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  在生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，液-液相分離驅(qū)動的無膜細胞器是揭示細胞區(qū)室化機制的核心方向。應(yīng)激顆粒等無膜細胞器通過相分離調(diào)控細胞應(yīng)激響應(yīng)，其快速組裝可保護mRNA和關(guān)鍵蛋白。同時，持續(xù)存在的應(yīng)激顆粒與癌癥化療耐藥性相關(guān)，索拉非尼等藥物療效因受激顆粒影響顯著降低。因此，靶向調(diào)控此類無膜細胞器成為克服耐藥性的潛在策略。盡管已有針對其成分蛋白或上游通路的小分子藥物，但缺乏直接融合無膜細胞器并調(diào)節(jié)其活性的方法。

  針對該挑戰(zhàn)，南開大學(xué)余志林教授課題組通過發(fā)展酶響應(yīng)相分離多肽Y^SO4F，制備了具有無膜細胞器靶向的原位相分離凝聚物，實現(xiàn)了無膜細胞器靶向的腫瘤有效治療。該多肽分子以“粘合子-間隔子-粘合子”為原型，連接病毒來源FGDF結(jié)構(gòu)域以靶向應(yīng)激顆粒核心蛋白G3BP2。在溶酶體硫酸酯酶催化下，Y^SO4F轉(zhuǎn)化為相分離多肽YF并形成凝聚液滴，通過與G3BP2結(jié)合實現(xiàn)與應(yīng)激顆粒融合，阻斷其對RACK1蛋白的隔離，激活促凋亡通路，顯著增強了索拉非尼的抗腫瘤效果，且生物安全性良好。該研究為靶向細胞器的癌癥治療提供了新策略。（圖1）

圖1.活細胞內(nèi)多肽原位相分離形成液滴并靶向應(yīng)激顆粒，與索拉非尼聯(lián)合進行癌癥化療示意圖。圖片來源Adv. Mater.。

  作者首先介紹了具有原位液-液相分離能力的多肽分子Y^SO4F的酶響應(yīng)水解以及酶響應(yīng)相分離能力。研究團隊設(shè)計了含雙硫酸化酪氨酸的多肽Y^SO4F，其結(jié)構(gòu)遵循“粘合子-間隔子-粘合子”基序，硫酸化修飾賦予其親水性及酶響應(yīng)性。體外實驗表明，Y^SO4F在硫酸酯酶催化下逐步脫去硫酸基團，轉(zhuǎn)化為疏水性多肽YF，進而發(fā)生液-液相分離形成球形液滴。熒光漂白恢復(fù)及液滴融合實驗證實，該液滴具有典型的凝聚體動態(tài)特性，半恢復(fù)時間為23.4s，表明分子在液滴與胞質(zhì)間快速交換（圖2）。

圖2.多肽Y^SO4F溶液中酶響應(yīng)水解與酶響應(yīng)相分離行為研究。圖片來源Adv. Mater.。

  接下來研究團隊對細胞內(nèi)的原位相分離過程進行了進一步研究（圖3），研究發(fā)現(xiàn)Y^SO4F通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入細胞，定位于溶酶體后經(jīng)硫酸酯酶催化去硫酸化，并通過質(zhì)子海綿效應(yīng)逃逸至細胞質(zhì)，最終發(fā)生液-液相分離形成液滴。共聚焦激光掃描顯微鏡顯示，胞質(zhì)內(nèi)形成的液滴具備典型的液-液相分離特征，其熒光漂白后恢復(fù)特性證實了液滴與周圍環(huán)境中分子的快速交換能力。對照實驗顯示，當使用硫酸酯酶抑制劑預(yù)處理癌細胞，或在不過表達該酶的正常成纖維細胞中，均未觀察到液滴形成，充分驗證了酶響應(yīng)是觸發(fā)原位相分離的關(guān)鍵條件。

圖3.多肽Y^SO4F癌細胞內(nèi)原位相分離行為研究。圖片來源Adv. Mater.。

  在無膜細胞器靶向研究中，研究團隊通過引入能特異性結(jié)合應(yīng)激顆粒核心蛋白G3BP2的配體FGDF，成功構(gòu)建了m-Y^SO4F-L^SG體系。該體系在腫瘤細胞內(nèi)形成的功能性液滴（d-YF-L^SG）可通過配體-蛋白識別作用，與應(yīng)激顆粒發(fā)生特異性融合，實現(xiàn)對這一無膜細胞器的精準靶向。微量熱泳動實驗表明，液滴微環(huán)境使FGDF-YF與G3BP2的結(jié)合親和力提升3.9倍，顯著增強了對應(yīng)激顆粒的募集效果。共聚焦激光掃描顯微鏡顯示，含有應(yīng)激顆粒靶向配體的m-Y^SO4F-L^SG體系具有優(yōu)異的應(yīng)激顆粒靶向能力。當與化療藥物索拉非尼聯(lián)合使用時，顯著提升了化療藥物對肺癌細胞的殺傷效力，使藥物半數(shù)抑制濃度大幅降低，細胞凋亡率顯著升高，為克服腫瘤化療耐藥性提供了關(guān)鍵的作用靶點和增效策略（圖4）。

圖4.m-Y^SO4F-L^SG對應(yīng)激顆粒靶向性與化療增效研究。圖片來源Adv. Mater.。

  研究團隊進一步對化療增效的機制進行研究，利用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察到，經(jīng)m-Y^SO4F-L^SG處理并聯(lián)合索拉非尼刺激的腫瘤細胞中，液滴熒光信號與另一種應(yīng)激顆粒核心組分TIA-1蛋白免疫熒光信號呈現(xiàn)高度共定位，線掃描分析顯示兩者重疊度顯著高于對照組。由于液滴未攜帶TIA-1靶向配體，這一現(xiàn)象直接證明液滴通過物理融合與應(yīng)激顆粒結(jié)合，而非單個蛋白募集。同時，共聚焦實驗結(jié)果表明液滴與應(yīng)激顆粒的融合能夠抑制其對RACK1蛋白的隔離。先前的研究表明，應(yīng)激顆粒主要通過隔離蛋白RACK1并抑制MTK1-SAPK信號通路，從而阻止p38磷酸化和caspase-3活化，促進細胞存活。蛋白印跡實驗表明，液滴與應(yīng)激顆粒的特異性融合觸發(fā)了MTK1蛋白的磷酸化激活，進而激活p38-MAPK信號通路級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致促凋亡關(guān)鍵因子caspase-3的剪切活化（圖5）。

圖5.m-Y^SO4F-L^SG的化療增效機制研究。圖片來源Adv. Mater.。

  最后，在荷瘤小鼠的體內(nèi)療效驗證中，研究團隊采用瘤內(nèi)注射m-Y^SO4F-L^SG 聯(lián)合腹腔注射索拉非尼的治療方案，結(jié)果顯示該聯(lián)合療法在21天的觀察期內(nèi)實現(xiàn)了顯著腫瘤體積抑制，優(yōu)于單一藥物治療組，展現(xiàn)出強大的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。免疫熒光分析進一步揭示，腫瘤組織中形成的功能性液滴與應(yīng)激顆粒核心蛋白 G3BP2的共定位系數(shù)高達0.77，直接證實了液滴對應(yīng)激顆粒的高效靶向能力。蛋白印跡檢測顯示，聯(lián)合治療組中p38磷酸化水平顯著升高，同時cleaved caspase-3蛋白表達量大幅增加，明確印證了caspase-3依賴凋亡通路的激活。重要器官的蘇木精和伊紅（H&E）染色及血液生化分析結(jié)果表明，m-Y^SO4F-L^SG體系具有良好的生物相容性。

圖6.m-Y^SO4F-L^SG的體內(nèi)抗腫瘤化療增效與生物安全性研究。圖片來源Adv. Mater.。

  這一成果近期發(fā)表在Advanced Materials上。南開大學(xué)碩士研究生王維庶和博士研究生王昊為共同第一作者，南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院余志林教授為通訊作者。相關(guān)研究得到了科技部重點研發(fā)項目、國家自然科學(xué)基金委、天津市科技局和海河實驗室經(jīng)費資助。

  論文信息：

  In Situ Liquid-Liquid Phase Separation of Peptides into Droplets Targeting Membraneless Organelles for Enhanced Cancer Chemotherapy

  Weishu Wang, Hao Wang, Zhilin Yu*.

  Advanced Materials.

  論文鏈接：https://doi.org/10.1002/adma.202420399