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天津工業大學高輝教授團隊 Nano Today：利用GalNAc衍生的納米平臺阻斷Fn-宿主細胞相互作用以增強結直腸癌的化療效果

2024-05-08 來源：高分子科技

結直腸癌（CRC）是發生在結直腸部位的消化道惡性腫瘤，其全球死亡率在惡性腫瘤中高居第二位。對于CRC中晚期患者來說化療仍是主要治療策略。然而，化療耐藥性導致的復發和轉移，使得化療的療效面臨嚴峻挑戰。越來越多的證據表明：CRC化療后的復發與一種特定的腸道微生物-具核梭桿菌（Fn）密切相關。Fn能夠通過其表面的凝集素Fap2與CRC細胞表面過度表達的Gal-GalNAc特異性結合黏附到CRC細胞，而CRC部位Fn的異常增殖會促進腫瘤的發展和轉移，誘導CRC細胞產生化療耐藥性。因此針對Fn進行靶向干預，減少其在腫瘤組織內的定植，有望顯著增強化療的治療效果，并降低癌癥復發的風險。

為此，天津工業大學高輝教授團隊提出了一種特異性抗Fn黏附策略，通過構建GalNAc衍生納米平臺（OGPA/P-C）來改善CRC的化療。這種CRC微環境適應性納米平臺可在腫瘤內靶向遞送抗癌藥物奧沙利鉑（OxPt），同時阻斷Fn與宿主細胞的相互作用，從而逆轉Fn引起的耐藥性，提高化療效果（圖1）。研究團隊首先將OxPt和偶氮苯（AZO）偶聯到GalNAc修飾的寡聚聚乙烯亞胺（OEI）上，再通過聚乙二醇-β-環糊精（PEG-CD）和偶氮苯基團的主客體相互作用組裝得到最終的納米平臺OGPA/P-C。其中PEG組分在納米表面形成的“隱形”保護層，不僅可以屏蔽GalNAc介導的肝臟靶向作用、還可以延長納米藥物的循環時間并增強其在腫瘤組織的蓄積；而在CRC相關偶氮還原酶觸發下納米平臺解組裝使得GalNAc暴露并通過Fap2依賴性競爭機制阻止Fn黏附于CRC上，逆轉Fn誘導的化療耐藥性；局部釋放化療藥物OxPt，有效增強抗腫瘤效果。

圖1. GalNAc衍生的抗黏附納米平臺通過阻斷Fn-宿主相互作用以增強CRC化療的示意圖。（a）OGPA的制備及其與PEG-CD通過超分子自組裝得到OGPA/P-C。（b）OGPA/P-C對Fn感染的CRC的治療機制：i）屏蔽GalNAc介導的肝臟靶向作用、延長納米藥物的血液循環時間并增強其在腫瘤組織的蓄積；ii）在CRC相關偶氮還原酶觸發下暴露GalNAc靶向Fn，干擾Fap2-Gal-GalNAc相互作用，從而阻斷Fn與CRC細胞的黏附，逆轉Fn誘導的化療耐藥性。iii）局部釋放化療藥物OxPt，有效消融CRC腫瘤。

研究團隊首先測定了OGPA/P-C的納米粒徑，血液穩定性以及其在腫瘤微環境中的響應性釋放藥物能力。如圖2c-d所示OGPA/P-C納米平臺的平均流體力學直徑為169.7 nm，SEM觀察到其形態為均勻的球形。此外，為了證明該納米粒子的穩定性，測定了其與含有10%血清的PBS共同培養孵育后的粒徑變化。結果顯示在長達100小時內OGPA/P-C納米平臺的粒徑大小和PDI沒有顯著變化，表明該納米平臺在血液中具有極佳的穩定性（圖2e）。此外，還利用Na₂S₂O₄作為CRC相關偶氮還原酶的模擬物來確定納米平臺的刺激響應行為。如圖2c所示，經Na₂S₂O₄處理后，由于OGPA和P-C之間的結構被破壞OGPA/P-C平均流體力學直徑從169.7 nm增至385.2 nm。紫外可見光譜也進一步證明了該結構的變化（圖2f）。通過ICP-MS對藥物釋放行為進行了測定，結果顯示OGPA/P-C納米平臺可在模擬CRC微環境中發生解離，從而觸發藥物的按需釋放（圖2g）。

圖2. GalNAc衍生的抗黏附納米平臺的合成與表征。（a）OGPA/P-C的制備示意圖。（b）OGPA和OGPA/P-C的紫外可見光譜。（c）通過DLS測定在有/無Na₂S₂O₄情況下OGPA/P-C納米平臺的水合粒徑分布。（d）OGPA/P-C的SEM圖像。（e）OGPA/P-C納米平臺在10%血清溶液中培養后的水合粒徑和PDI。（f）Na₂S₂O₄存在（藍線）和不存在（紅線）時OGPA/P-C納米平臺的紫外可見光譜。（g）在有/無Na₂S₂O₄情況下，Pt從OGPA/P-C納米平臺中的累積釋放曲線。

研究人員隨后探究了OGPA/P-C與Fn的靶向結合機制（圖3a）。如圖3b所示，在與負載ICG的OGPA/P-C（ICG@OGPA/P-C）共培養后，細菌周圍沒有熒光產生，表明ICG@OGPA/P-C與Fn沒有結合。但在加入偶氮還原酶后可以觀察到明顯的紅色熒光，且熒光強度與OGPA組相當，該結果表明，在偶氮還原酶作用下PEG脫屏蔽，暴露的GalNAc會與Fn產生強大的結合效應。此外，當Fn與游離的GalNAc孵育后再用負載ICG的OGPA（ICG@OGPA）處理時，細菌的紅色熒光會大幅減少，這表明OGPA與Fn的結合是由Fap2-GalNAc相互作用介導的。

圖3. OGPA/P-C與Fn的靶向結合。（a）OGPA/P-C與Fn的結合機制。（b）CLSM觀察不同組分處理后的Fn
接下來研究人員在體外測定了OPGA/P-C對Fn黏附腫瘤細胞的抑制作用（圖4a）。結果表明，CT26和HCT116兩種細胞都有較高的Gal-GalNAc表達水平，并且GalNAc和GalNAc衍生的納米平臺都具有抑制Fn在CT26和HCT116細胞表面定植的能力（圖4b-i）。

圖4. 體外抑制Fn黏附CRC細胞。（a）OGPA/P-C阻斷Fn黏附CRC細胞示意圖。（b）CLSM圖像顯示FITC標記的Fn與CT26和（c）HCT116細胞的黏附情況。（d-e）FITC熒光定量分析。（f）CLSM圖像顯示CT26和（g）HCT116細胞經不同樣品處理后Fn的黏附情況。(h-i）FITC熒光定量分析。

為了進一步驗證GalNAc是否可以通過抑制Fn對CRC細胞的黏附從而逆轉CRC細胞的化療耐藥性，在Fn感染的細胞模型中評估了納米平臺的抗腫瘤活性。結果顯示OxPt對Fn感染細胞的細胞毒性顯著降低，即Fn可誘導HCT116和CT26細胞對OxPt產生化學耐藥性。然而，在加入游離的GalNAc以后，CT26/Fn和HCT16/Fn組細胞的存活率均有所下降，并且隨著GalNAc濃度的不斷增加，細胞的存活率呈現出比較明顯的下降趨勢，該結果表明GalNAc可以克服Fn誘導的CRC耐藥性（圖5a-b）。隨后進一步研究了OGPA/P-C對Fn感染的CRC細胞的作用。如圖5c-d所示，用含有GalNAc的OGP和OGPA/P-C處理Fn感染的CT26和HCT116細胞后，其細胞活力低于不含GalNAc的OP和OPA/P-C，該結果表明GalNAc衍生的納米平臺可通過阻斷Fn-宿主細胞間的相互作用有效逆轉CRC細胞的耐藥性。研究表明，Fn通過激活自噬途徑誘導CRC的化療耐藥性，進一步損害化療效果。因此研究人員使用AO染色法和蛋白印跡法評估了Fn感染的CT26細胞在不同組分處理后的自噬活性。結果表明Fn會誘導CT26細胞發生自噬，而用OGPA/P-C處理Fn感染的CT26細胞后，其自噬活性顯著降低（圖5e-f）。即OGPA/P-C通過阻斷Fn對CRC細胞的黏附可有效抑制Fn誘導的自噬激活進而克服化療耐藥性（圖5g）。

隨后在BALB/c雄性小鼠腫瘤模型中，利用尾靜脈注射ICG標記的OGPA、OGPA/P-C和游離ICG來評估藥物在體內的生物分布以及在腫瘤部位的積累。結果如圖5h-j所示，在整個檢測期間OGPA/P-C組在腫瘤中的富集程度最高。在注射后24小時，由于GalNAc具有很強的肝臟靶向能力，OGPA大量積聚在肝臟中，而OGPA/P-C則積聚在腫瘤部位，這些結果表明，PEG的引入很好的屏蔽了GalNAc的肝臟靶向性。

圖5. 體外抗腫瘤活性和體內生物分布評估。（a）OxPt和GalNAc對CT26和Fn感染的CT26細胞的細胞毒性。（b）OxPt和GalNAc對HCT116和Fn感染的HCT116細胞的細胞毒性。（c）含有不同Pt濃度的樣品對CT26和Fn感染的CT26細胞的細胞毒性。（d）不同Pt濃度（0-100 μM）的樣品對HCT116和Fn感染的HCT116細胞的細胞毒性。（e）經PBS、OPA/P-C和OGPA/P-C處理后，Fn感染CT26細胞的AO染色圖像。（f）相應的紅綠比定量分析。（g）OGPA/P-C通過阻斷Fn-宿主相互作用和抑制自噬激活來恢復OxPt活性示意圖。（h）ICG、ICG@OGPA和ICG@OGPA/P-C經尾靜脈注射到攜帶CT26腫瘤的BALB/c小鼠體內后0.5、1、3、6、9和24小時的生物分布（n = 3）。（i）體內成像和（j）給藥后24小時離體器官和腫瘤中ICG的熒光定量分析。

最后研究團隊探究了OGPA/P-C在體內的抗腫瘤效果。通過對小鼠腫瘤體積，小鼠體重、存活率以及主要器官的檢測，發現相比于傳統抗腫瘤藥物OxPt，OGPA/P-C具有更優越的體內抗腫瘤效果和更顯著的生物安全性，并且結合免疫組化實驗結果進一步說明OGPA/P-C可通過阻斷Fn與CRC細胞的黏附，從而抑制自噬激活，克服Fn誘導的化療耐藥性（圖6a-g）。

圖6. 抗黏附和體內抗腫瘤性能。（a）小鼠接種腫瘤細胞和治療示意圖。（b）不同治療后小鼠腫瘤生長曲線（n = 6）。（c）治療15天后切除腫瘤的代表性照片。（d）不同樣品治療后小鼠在40天內的存活率。其中（+）和（-）指靜脈注射Fn與否。（e）具有代表性的腫瘤切片免疫組化染色。（f）不同樣品治療后小鼠體重的變化。（g）小鼠在不同樣品治療后主要器官和腫瘤的代表性H&E染色圖像。

總之，該研究團隊成功開發了一種非致死性策略，通過利用GalNAc衍生的抗黏附納米平臺（OGPA/P-C）特異性阻斷Fn-宿主細胞相互作用來逆轉Fn誘導的化療耐藥性，從而增強Fn相關CRC的化療效果。該團隊提出的非致死性抗黏附策略為提高Fn感染的CRC和其他實體瘤的化療效果提供了一種創新思路。

以上研究成果以“Blocking Fusobacterium nucleatum-host cell interactions with responsive supramolecular GalNAc-derived nanoplatform for enhanced chemotherapy in colorectal cancer”為題，發表于期刊Nano Today（2024, 24, 102288. DOI: 10.1016/j.nantod.2024.102288）。天津工業大學高輝教授和余云健講師為通訊作者，天津工業大學武騰玲講師和天津理工大學碩士研究生靳丹陽為共同第一作者。這項工作得到了國家自然科學基金、天津市自然科學基金重點項目、天津市特聘教授以及天津市透明質酸應用研究企業重點實驗室開放基金的支持。

文章鏈接：https://doi.org/10.1016/j.nantod.2024.102288

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（責任編輯：xu）

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