華東理工劉潤輝教授課題組 Nat. Microbiol.：細胞膜和DNA雙靶點抗耐藥真菌
耐藥真菌嚴重威脅人類生命健康，傳統的單靶點抗真菌藥物難以應對耐藥真菌的迅速發展。雙靶點藥物有望通過作用于微生物的多個途徑顯著降低真菌耐藥發生，在藥物研究中具有很大前景。因此，設計和發現雙靶點抗耐藥真菌新分子對耐藥真菌感染治療和應對真菌耐藥性挑戰具有重要意義。然而，發現具有高活性、高選擇性的雙靶點抗耐藥真菌活性分子是本領域重大挑戰，一直未取得突破。
近期，劉潤輝教授課題組首次設計并發現了具有高活性和高選擇性的雙靶點高效抗耐藥真菌新分子，解析了新分子通過真菌細胞膜和DNA雙靶點抗耐藥真菌新機制，提出了雙靶點抗耐藥真菌活性分子的設計策略，為抗耐藥真菌藥物新機制研究和應對抗真菌耐藥性挑戰提供了新思路。該成果以“A dual-targeting antifungal is effective against multi-drug resistant human fungal pathogens”發表在Nature Microbiology (Nat. Microbiol, 2024, DOI: 10.1038/s41564-024-01662-5)。
臨床抗真菌藥物數量有限且往往伴隨著嚴重的毒副作用，導致真菌感染對人類健康構成重大威脅，真菌耐藥性的迅速出現和傳播加劇了這一現狀。雙靶點藥物可同時作用于微生物的多個途徑，可有效減緩耐藥性的產生，在藥物研究中具有很大前景。盡管臨床中通過兩種藥物聯用的替代方案實現雙靶點抗耐藥真菌，但兩種藥物在體內的分布和藥代動力學各不相同，使得治療效果受到限制。真菌和哺乳動物細胞同作為真核細胞結構高度相似，導致抗真菌靶點有限，即使發現單一靶點的選擇性抗真菌分子也極其困難。因此，雙靶點藥物在抗真菌研究領域一直未取得突破。
劉潤輝教授課題組在前期研究中，提出了以優異生物安全性的聚噁唑啉（多肽主鏈上酰胺鍵轉移至側鏈）模擬天然多肽，創新性地實現了基于聚噁唑啉骨架的功能性多肽模擬，發現了體內外高效抗耐藥細菌和耐藥真菌的聚噁唑啉活性分子（Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 6412，VIP論文，ESI高被引；Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202200778，VIP論文；J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 25753，JACS Spotlight）。本研究中進一步提出通過正電荷和兩親性的聚噁唑啉模擬宿主防御肽同時引入DNA結合基團作為疏水性結構的設計策略，通過調控正電荷和DNA結合基團的比例成功獲得了高活性、高選擇性雙靶點抗耐藥真菌新分子。雙靶點活性分子對多種臨床常見耐藥真菌（包括念珠菌屬、新生隱球菌、格特隱球菌和煙曲霉菌）具有高活性和高選擇性，在角膜炎、擦傷、系統感染等多個小鼠感染模型中展示優異治療耐藥真菌感染效果，為抗耐藥真菌藥物設計和新機制研究提供了新思路（圖1）。
圖 1 真菌細胞膜和DNA雙靶點的HDP模擬聚噁唑啉的設計策略與抗耐藥真菌感染性能
本研究首先設計可與DNA通過π-π作用結合的萘基作為聚噁唑啉的疏水基團，側鏈氨基為正電荷基團，通過2-噁唑啉單體共聚合成了不同正電荷和DNA結合基團比例的HDP模擬聚噁唑啉分子庫，并探究了一系列聚噁唑啉的抗耐藥真菌活性和哺乳動物細胞以及血紅細胞毒性。其中，DNA結合基團比例20%的聚噁唑啉 (Gly0.8Nap0.2)20的抗耐藥真菌活性（MIC=0.78–3.13 μg/mL）與抗耐藥真菌藥物兩性霉素B相當（MIC=0.78–1.56 μg/mL），對血紅細胞和成纖維細胞的選擇性（HC50/MIC=1–2, IC50/MIC=1–2）遠超過兩性霉素B（HC50/MIC=1–2, IC50/MIC=1–2），表明優選聚噁唑啉 (Gly0.8Nap0.2)20具有出優異的抗耐藥真菌活性與抗真菌選擇性（圖2）。
圖 2 HDP模擬聚噁唑啉的合成、表征與體外抗耐藥真菌活性
優選HDP模擬聚噁唑啉 (Gly0.8Nap0.2)20優異的抗耐藥真菌性能促使他們研究其抗真菌機制。通過共聚焦顯微鏡研究觀察熒光標記的聚噁唑啉的動態殺菌過程，發現(Gly0.8Nap0.2)20在加入真菌溶液后立即積聚在真菌表面并逐漸進入真菌細胞質。孵育 60 秒后， 在真菌細胞質中觀察到大量的(Gly0.8Nap0.2)20，但沒有 PI 信號。72 秒后，在真菌細胞質中觀察到紅色熒光 PI 信號，表明真菌被殺死。值得注意的是，(Gly0.8Nap0.2)20與真菌共孵育后，真菌的 ζ 電位從?5.3 mV 變為+11.9 mV。進一步研究發現 (Gly0.8Nap0.2)20顯示出可忽略的真菌細胞壁擾動和明顯的真菌質膜去極化。此外，添加帶有負電荷的外源真菌膜脂質成分磷脂酰肌醇和磷脂酰甘油后 (Gly0.8Nap0.2)20的抗真菌活性被顯著抑制，通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察到 (Gly0.8Nap0.2)20處理后的白色念珠菌 K1細胞膜出現明顯受損。以上研究表明了細胞膜作為 (Gly0.8Nap0.2)20的一個抗真菌作用靶點（圖3）。
圖 3 雙靶點聚噁唑啉 (Gly0.8Nap0.2)20的真菌膜作用靶點研究
進一步通過共聚焦顯微鏡觀察在DNA結合染料DPAI （結合后為藍色熒光）存在下 (Gly0.8Nap0.2)20對白色念珠菌 K1 的殺菌過程，他們發現 (Gly0.8Nap0.2)20在真菌細胞質中不斷富集隨后逐漸進入真菌細胞核，在進入整個真菌細胞核超過 30 秒后，真菌細胞質中突然出現紅色熒光 PI 信號，表明真菌被殺死。隨后，真菌DNA-DAPI 結合產生的藍色熒光逐漸消退，意味著與DNA結合的DPAI可能被 (Gly0.8Nap0.2)20取代。他們從真菌中提取出DNA 并將其與 (Gly0.8Nap0.2)20的共孵育，發現DNA粒徑從 47nm 增大 154nm；進一步研究 (Gly0.8Nap0.2)20對 不同的DNA 結合染料的競爭性置換實驗，結果發現 (Gly0.8Nap0.2)20對DAPI（一種代表性的 DNA 小凹槽結合染料）和EB（一種代表性的DNA嵌入染料）都顯示顯著的熒光猝滅效果。同時，在真菌 DNA 中加入 (Gly0.8Nap0.2)20后的紫外、圓二色譜和ζ 電位測試結果也表明 (Gly0.8Nap0.2)20對DNA的結合。在抗菌測試中添加外源的DNA，(Gly0.8Nap0.2)20的抗真菌活性被顯著抑制。這些結果共同表明了(Gly0.8Nap0.2)20通過作用于真菌細胞膜和DNA雙靶點殺菌機制（圖4）。
圖 4 雙靶點聚噁唑啉 (Gly0.8Nap0.2)20的真菌DNA作用靶點研究
在小鼠角膜炎和皮膚擦傷感染模型感染中，雙靶點聚噁唑啉 (Gly0.8Nap0.2)20均顯示了與臨床抗真菌藥物相當的耐藥真菌感染治療效果，(Gly0.8Nap0.2)20顯著降低了感染部位的菌落負荷，減少了菌絲入侵的嚴重程度，并且未發現明顯毒性，展示了突出的耐藥真菌局部感染治療潛力（圖5）。
圖 5 雙靶點聚噁唑啉 (Gly0.8Nap0.2)20有效治療耐藥真菌角膜炎和皮膚擦傷感染
在白色念珠菌誘導的小鼠系統感染模型中，雙靶點聚噁唑啉 (Gly0.8Nap0.2)20有效救治感染小鼠，并提高感染小鼠的存活率，存活率與臨床抗真菌藥物兩性霉素B相當。并且 (Gly0.8Nap0.2)20能夠清除小鼠多個器官中的真菌，降低真菌負荷，阻止真菌對心、腎等器官的入侵。此外，處理后小鼠的組織學分析和血液生化指標結果顯示 (Gly0.8Nap0.2)20具有優異的體內生物相容性和安全性，表明(Gly0.8Nap0.2)20具有優異的耐藥真菌系統感染治療潛力（圖6）。
圖 6 雙靶點聚噁唑啉 (Gly0.8Nap0.2)20有效治療耐藥真菌系統感染
華東理工大學材料科學與工程學院副研究員周敏、博士研究生劉龍強是論文的第一作者，劉潤輝教授為通訊作者。該成果得到了國家自然科學基金委杰出青年科學基金、科技部重點研發項目等基金的資助。
論文鏈接: https://www.nature.com/articles/s41564-024-01662-5
