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  酶的熱效應對于研究生命現(xiàn)象、生理特征具有重要價值。生命活動受到各種生物酶的調(diào)控，一方面酶本身的活性受到周圍溫度影響，另一方面酶催化放熱反應釋放的熱量維持著酶周圍環(huán)境的溫度，研究酶促反應過程中的熱量變化具有重要意義。然而，單個酶分子釋放的熱量很少，熱量會迅速擴散到周圍環(huán)境達到熱平衡，現(xiàn)有測量方法如微量熱法測量的是整體熱平衡后的熱量情況，無法實時檢測酶分子非平衡放熱情況，目前缺乏微納米尺度熱量變化監(jiān)測的有力工具。

  近來，光學納米溫度計的發(fā)展為解決上述問題提供了思路。光學納米溫度計是指具有溫度響應性的納米粒子，通常其光學特性會隨溫度改變，通過測量納米溫度計光學特性變化能獲得被測物的溫度變化。由于光學信號可以實時獲得（采集間隔小于1秒），動態(tài)地監(jiān)測整個放熱過程，具有高時間分辨率；而納米溫度計的粒徑小于10 nm納米，其尺寸與一些大分子蛋白質(zhì)相當，可以實現(xiàn)高空間分辨率。因此理論上講納米溫度計可以實現(xiàn)生物大分子（如酶）微區(qū)域?qū)崟r非平衡態(tài)的溫度（熱量）變化測量。

圖1 酶的微區(qū)域溫度實時測量示意圖

  近日，西安交通大學生命學院生物醫(yī)學影像與應用研究所吳道澄教授課題組提出了一種可以在微納米尺度下準確、實時監(jiān)測酶促反應中放熱情況的新方法（圖1）。文中合成了一種表面帶有大量氨基的AgInS₂量子點，該量子點的熒光強度具有顯著的溫度依賴性，熒光強度接近線性地隨溫度升高而降低，靈敏度為-2.82%°C^-1。通過化學交聯(lián)將量子點緊密地連接到被測物脂肪酶上，確保量子點檢測酶周圍的溫度而不是溶液溫度。在連接了量子點的脂肪酶溶液中加入底物，利用熒光分光光度計實時地檢測溶液熒光變化，發(fā)現(xiàn)隨著底物加入溶液熒光強度迅速減弱，經(jīng)換算脂肪酶最大溫差超過溶液6°C，直到底物消耗完才回復到初始值（圖2）。該方法具有良好的重現(xiàn)性，最大誤差約為4%，溫度分辨率約為0.5°C，時間分辨率2秒，可以檢測低至0.02 mg/mL的酶溶液。該體系的熒光信號直接代表了酶周圍納米尺度微區(qū)域的溫度變化，實現(xiàn)了對酶促反應中非平衡放熱的檢測。這種酶周圍熱量分布的不均勻性對于研究納米尺度生物體內(nèi)的熱行為和生物特性具有重要意義。該方法對于研究生物體內(nèi)各種與熱有關的酶過程、線粒體內(nèi)的熱釋放甚至腫瘤熱療中的溫度反饋都有重要的應用前景。

圖2. 酶-量子點復合物在加入底物后的熒光強度變化及對應的溫度變化。（a）在Lipase-QDs中加入10μL底物進行三次平行測試，加入10μL PBS作為空白對照，記錄熒光強度隨時間的變化。（b）在相同Lipase-QDs溶液中加入不同量（5，10，15μL）的底物，記錄熒光強度隨時間的變化。（c）將b圖中前120秒的熒光變化換算為溫度變化，以熱電偶檢測的溶液溫度作為對照。（d）在不同溫度下的Lipase-QDs溶液中加入相同底物，記錄熒光強度隨溫度的變化。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示（n = 3）。

  近日，該成果以“基于溫度敏感的氨基-AgInS₂量子點的一種準確、實時的酶微區(qū)域放熱檢測方法”（Accurate and Real-time Detection Method for the Exothermic Behavior of Enzymatic Nano-microregions Using Temperature-sensitive Amino-AgInS₂ Quantum Dots）為題在國際著名學術期刊Small Methods (IF=14.1)上在線發(fā)表，第一作者為西安交通大學生命學院博士生張慧，吳道澄教授為唯一通訊作者，西安交通大學生命學院為該論文的第一和唯一通訊作者單位。該研究成果是吳道澄教授課題組在納米溫度計及其生物應用方面（ACS Appl. Mater. Inter. 2017, 9(12):11073-11081.；ACS Appl. Mater. Inter 2016,8(23):14396-14405.；J. Mater. Chem B. 2019,7,2835--2844.）的又一重要成果。

  該工作得到了國家自然科學基金和國家重大科學儀器設備項目的資助。西安交通大學分析測試中心為本工作提供了大量測試表征支持。

  論文鏈接：https://doi.org/10.1002/smtd.202100811