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  細胞膜作為細胞的邊界，不僅在結(jié)構(gòu)上為細胞提供了一個相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，并且參與了包括物質(zhì)運輸、信號傳導、細胞凋亡和細胞自噬在內(nèi)的許多重要生理活動。利用熒光探針對細胞膜進行標記和示蹤的成像技術(shù)是研究細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的一項重要手段。目前市售的細胞膜染料及大多數(shù)文獻報道的細胞膜熒光探針都僅適用于體外層面的研究，而如何在活體動物內(nèi)實現(xiàn)對細胞膜的原位熒光標記仍是一項亟待解決的技術(shù)難題。這不僅要求熒光探針能夠穿過復雜的細胞外基質(zhì)與細胞膜結(jié)合，而且還要具有信噪比高和“免清洗”成像等特點。

  日前，東南大學生物科學與醫(yī)學工程學院、生物電子學國家重點實驗室的吳富根教授課題組在之前報道的一系列基于疏水錨定的細胞膜修飾策略的基礎(chǔ)上（J. Mater. Chem. B, 2015, 3, 6165；J. Mater. Chem. B, 2016, 4, 834；Bioconjugate Chem. 2016, 27, 782；ACS Biomater. Sci. Eng. 2016, 2, 987；Langmuir 2016, 32, 10126；ACS Biomater. Sci. Eng. 2017, 3, 2570；ACS Appl. Mater. Interfaces 2017, 9, 15943；J. Control. Release 2017, 255, 231；J. Control. Release 2018, 286, 103.），開發(fā)了一種免清洗的細胞膜紅色熒光探針。該熒光探針（命名為Chol-PEG-Cy5）包含一個由膽固醇（Chol）分子構(gòu)成的疏水錨定基團，一段用于增強水溶性的聚乙二醇（PEG）高分子，以及一個紅色熒光分子Cy5。如圖1所示，由于在水溶液中Cy5分子之間容易形成二聚體的結(jié)構(gòu)進而發(fā)生分子間共振能量轉(zhuǎn)移，該探針的熒光發(fā)射會在一定程度被淬滅；而當膽固醇分子錨定至細胞膜上時，細胞膜的流動性會驅(qū)使熒光探針發(fā)生側(cè)向擴散，從而打破了Cy5分子間的二聚體狀態(tài)并實現(xiàn)了熒光增強。實驗結(jié)果顯示，該熒光探針不僅在體外實驗中實現(xiàn)了高質(zhì)量的免清洗細胞膜熒光成像（圖2），而且能夠?qū)Π唏R魚胚胎的表皮細胞膜進行原位熒光標記（圖3）。

圖1 熒光探針Chol-PEG-Cy5的免清洗成像及斑馬魚胚胎表皮細胞膜成像的原理圖。

圖2 熒光探針Chol-PEG-Cy5可實現(xiàn)對各類細胞的細胞膜熒光成像。

圖3 經(jīng)過三維重建的斑馬魚胚胎表皮細胞膜熒光成像圖片。

  由于斑馬魚胚胎的表面覆蓋有親水性的黏液層，這使得疏水性的膜染料很難與內(nèi)部的表皮細胞接觸，而Chol-PEG-Cy5在PEG鏈的協(xié)助下則能夠穿過黏液層并最終錨定在表皮細胞膜上。相比于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因熒光標記和免疫熒光染色等方法，該策略具有染色時間短（約10分鐘）、方法簡便、成本低廉、可活體成像等優(yōu)勢。隨后，該課題組利用這種熒光探針動態(tài)監(jiān)測了斑馬魚胚胎眼部區(qū)域的表皮細胞在發(fā)育過程中的形態(tài)變化（圖4），并且發(fā)展了一種用于評價納米材料（如金納米顆粒和氧化石墨烯納米片）對斑馬魚表皮組織毒性的新方法（圖5）。

圖4 處于不同發(fā)育階段的斑馬魚胚胎的眼部明場照片及熒光成像圖片。

圖5 經(jīng)金納米顆粒或氧化石墨烯納米片處理后的斑馬魚胚胎的熒光成像圖片及存活率曲線。

  相關(guān)研究成果以“Efficient cell surface labelling of live zebrafish embryos: wash-free fluorescence imaging for cellular dynamics tracking and nanotoxicity evaluation”為題在線發(fā)表于Chemical Science。東南大學的博士生賈浩然和祝雅璇為該論文的共同第一作者，東南大學的吳富根教授為該論文的通訊作者。該工作得到了國家自然科學基金、江蘇省自然科學基金和東南大學研究生院科研基金等項目的大力支持。

  論文鏈接：https://doi.org/10.1039/C8SC04884C