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  當(dāng)前全球老齡化形勢嚴(yán)峻，老年患者骨再生能力不足。一方面，衰老骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）成骨分化能力顯著下降，線粒體功能障礙導(dǎo)致能量代謝異常。另一方面，衰老相關(guān)分泌表型（SASP）產(chǎn)生促炎因子和活性氧（ROS），抑制成骨和血管生成�，F(xiàn)有療法存在局限，單純清除衰老細(xì)胞和抑制SASP未能同時(shí)解決BMSCs與微環(huán)境間的復(fù)雜交互作用。

  針對以上難題，蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院朱雪松/張一健/蔣定華團(tuán)隊(duì)和華東理工大學(xué)袁媛團(tuán)隊(duì)聯(lián)合開發(fā)了一種過表達(dá)NAD依賴性去乙�；�Sirtuin 3（SIRT3）的聚癸二酸甘油-共聚乙二醇/聚丙烯酸（PEGS /PAA）水凝膠，并用于治療老年性骨缺損。此基因工程水凝膠的主要創(chuàng)新點(diǎn)在于：1. 通過緩解BMSCs的衰老損傷并清除SASPs，顯著促進(jìn)成骨分化；2. 通過螯合周圍鐵離子，構(gòu)建了局部促骨生成的低氧微環(huán)境；3. 通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化相關(guān)的免疫信號通路，加速老年骨組織修復(fù)。

  該工作以"An "inside-out"-guided genetically engineered hydrogel for augmenting aged bone regeneration" 為題發(fā)表于《Bioactive Materials》雜志。

圖1. 基于“內(nèi)外兼修”理念設(shè)計(jì)基因工程水凝膠并用于治療老年性骨損傷示意圖。過表達(dá)SIRT3的PEGS /PAA@SIRT3水凝膠的制備流程。在細(xì)胞內(nèi)，SIRT3過表達(dá)增強(qiáng)成骨能力，減輕BMSCs的衰老損傷（胞內(nèi)作用）。在細(xì)胞外，PEGS /PAA中的羧基螯合鐵離子以模擬缺氧條件并促進(jìn)HIF-1α表達(dá)（胞外效應(yīng)）。這些聯(lián)合機(jī)制延緩細(xì)胞衰老，促進(jìn)骨愈合。

  通過構(gòu)建成年（6月齡）和老齡（18月齡）大鼠臨界顱骨缺損模型，評估骨缺損修復(fù)能力差異。使用單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析衰老環(huán)境對骨組織細(xì)胞亞群的改變，并篩選出SIRT3在衰老進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。成年大鼠在骨組織損傷后的再生情況表現(xiàn)出良好的愈后，而隨著年齡的增加，老齡大鼠的細(xì)胞表現(xiàn)出衰老表型P21、P16蛋白的組織內(nèi)陽性率明顯增多，嚴(yán)重影響了骨組織的整合再生能力，表現(xiàn)為骨缺損的不愈合。單細(xì)胞測序的結(jié)果顯示，單細(xì)胞測序顯示祖細(xì)胞及成骨細(xì)胞群體豐度減少，細(xì)胞周期G2/M期阻滯，其特征是G2M其的增多和對低氧刺激的高敏感性。此外，衰老的骨微環(huán)境損害了膠原形成和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，SIRT3高表達(dá)的成骨細(xì)胞以及BMSCs豐度顯著下降，表明SIRT3在協(xié)調(diào)骨形成中的重要調(diào)節(jié)作用（圖2）。

圖2. 通過體內(nèi)熒光染色和單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析篩選出調(diào)控衰老進(jìn)程的關(guān)鍵靶點(diǎn)SIRT3。

  作者通過巰基-邁克爾加成反應(yīng)合成PEGS/PAA互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠，并負(fù)載包裹AAV-SIRT3的介孔二氧化硅納米顆粒。FTIR、XPS、SEM、EDS等結(jié)果均證實(shí)了水凝膠的成功制備，同時(shí)具有豐富的孔隙結(jié)構(gòu)，體外釋放實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了水凝膠的封裝使得納米顆粒實(shí)現(xiàn)了持續(xù)28天以上的緩釋效應(yīng)。相比單純PEGS水凝膠，PEGS/PAA@SIRT3水凝膠更好的實(shí)現(xiàn)了水凝膠在體外的降解和藥物緩釋功能，較好的解決了基因修飾納米顆�？焖俳到�、效能不穩(wěn)定的問題。這無疑模擬了更好的骨組織微環(huán)境，同時(shí)也為損傷細(xì)胞提供了基因編輯的平臺（圖3）。

圖3. PEGS/PAA@SIRT3水凝膠的制備與表征。

  作者后續(xù)使用體外水凝膠與衰老細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、PCR、WB等實(shí)驗(yàn)，共同驗(yàn)證了PEGS/PAA@SIRT3水凝膠能夠有效恢復(fù)正常細(xì)胞周期，減少衰老相關(guān)分泌表型，β-半乳糖苷酶染色、細(xì)胞免疫熒光染色也得到相同結(jié)論（圖4）。

圖4. PEGS/PAA@SIRT3水凝膠的對衰老進(jìn)程的延緩作用。

  此外，PCR、WB、堿性磷酸酶染色、茜素紅染色等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEGS/PAA@SIRT3水凝膠體系在衰老細(xì)胞中能夠顯著加速成骨分化，上調(diào)成骨相關(guān)標(biāo)志物，促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)沉積，有效抵御衰老導(dǎo)致的成骨能力下降（圖5）。

圖5. PEGS/PAA@SIRT3水凝膠的對成骨分化的促進(jìn)作用。

  RNA-seq富集分析的結(jié)果顯示PEGS/PAA@SIRT3水凝膠導(dǎo)致多個骨免疫相關(guān)通路和因子出現(xiàn)差異性表達(dá)，研究者們使用流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞免疫熒光等方法探究了PEGS/PAA@SIRT3水凝膠對巨噬細(xì)胞極化的潛在影響，結(jié)果表明，PEGS/PAA@SIRT3顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化，抑制M1型極化，構(gòu)建了促成骨分化的免疫微環(huán)境（圖6）。

圖6. PEGS/PAA@SIRT3水凝膠對骨免疫的調(diào)控作用。

  作者后續(xù)構(gòu)建老齡大鼠的臨界骨缺損模型，并以此驗(yàn)證PEGS/PAA@SIRT3水凝膠的體內(nèi)療效。Micro-CT重建分析顯示PEGS/PAA@SIRT3組骨再生進(jìn)程顯著加快。術(shù)后8周，PEGS/PAA@SIRT3組標(biāo)本的骨連續(xù)性成功恢復(fù)，伴隨著故體積分?jǐn)?shù)、骨密度、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量的顯著上升（圖7）。

圖7. PEGS/PAA@SIRT3水凝膠對老齡大鼠骨缺損的治療作用。

  為了進(jìn)一步證明SIRT3在骨愈合過程中的作用，研究者在SIRT3敲除小鼠體內(nèi)構(gòu)建顱骨臨界骨缺損模型，并以此揭示PEGS/PAA@SIRT3水凝膠的優(yōu)越性。Micro-CT重建分析顯示PEGS/PAA@SIRT3組骨再生進(jìn)程顯著加快。免疫組化結(jié)果證明，該水凝膠在敲除SIRT3的條件下仍舊能夠補(bǔ)充SIRT3的含量，在骨組織中抑制衰老標(biāo)志物P16的表達(dá)，并促進(jìn)骨鈣素（OCN）的增加（圖8）。

圖8. PEGS/PAA@SIRT3水凝膠有效促進(jìn)SIRT3敲除小鼠的骨缺損修復(fù)。

  總而言之，PEGS/PAA@SIRT3水凝膠通過靶向遞送SIRT3、模擬缺氧微環(huán)境及調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)，有效逆轉(zhuǎn)老年骨缺損區(qū)的衰老微環(huán)境，為臨床治療衰老相關(guān)性骨疾病提供創(chuàng)新性解決方案。

  原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X25001896?via%3Dihub