清華大學陳國強教授、吳瓊副教授 Adv. Sci.: 以聚羥基脂肪酸酯為例探究細胞體積大小對工業生產的影響
大多數細菌只有1~2微米大，這樣微小的空間限制了胞內產物（如聚羥基脂肪酸酯，PHA）的積累。細胞體積的大小主要受mreB、minCD等關鍵基因的調控，但改變這些基因的表達量對生長產生負面影響。因此，開發一種在不影響細胞生長的前提下增大細胞體積的方法顯得尤為重要。本研究通過改造細菌內的ClpXP蛋白降解系統，實現對MreB蛋白的可控降解。在此基礎上，通過過表達PHA合成相關基因phaAB并敲除PHA顆粒表面蛋白PhaP1，成功實現了細胞體積的顯著增大（超過9倍）以及PHA產量的提升。在5噸發酵罐中，改造后的鹽單胞菌CYL0307在發酵44小時后，干重達到149g/L，PHA含量達到82%。
細菌的微小體積限制了胞內產物的積累，然而對細胞骨架蛋白MreB以及分裂相關蛋白MinCD的調控對細菌生長造成負面影響。因此，需要開發一種在不影響細菌生長的前提下增大細胞體積的方法。本研究改造細菌內的ClpXP蛋白降解系統并將其應用于MreB的可控降解，在此基礎上敲除PHA顆粒表面蛋白PhaP1同時過表達PHA合成相關基因phaAB，最終成功實現了細胞體積的顯著增大（九倍以上），PHA產量的提高和下游提取過程的簡化。
細菌內有多種蛋白降解系統，其中研究最為廣泛的是ClpXP蛋白降解系統。在翻譯過程中，當蛋白質在核糖體上發生停滯時，細菌內的tmRNA（transfer-messenger RNA）會在停滯蛋白的C端加上SsrA標簽。該SsrA標簽可以與細菌內的ClpXP蛋白酶特異性結合，從而促使停滯蛋白被降解。在本研究中，他們通過突變SsrA標簽的序列，調節其與ClpXP蛋白酶之間的相互作用強度，進而開發出一系列具有不同降解速率的突變標簽（圖1）。
圖1 突變后具有不同降解速率的標簽
在此基礎上，他們將突變后具有不同降解速率的SsrA標簽的DNA序列插入細菌基因組中mreB基因的終止密碼子前，使MreB蛋白在翻譯時就帶有SsrA標簽。鑒于MreB蛋白在維持細菌桿狀形態中的關鍵作用，通過調節其降解速率，他們期望能夠增加細菌寬度，獲得更接近球形的細菌。通過顯微鏡觀察，他們發現所有經過基因編輯的細菌均呈現出更大的橢球狀形態，而對照菌株CYL0119則保持了較小的桿狀形態（圖2A）。進一步測試這些細菌的干重和PHA含量后發現，與對照菌株相比，經過改造的工程菌株CYL0212的干重和PHA含量分別提高了14.2%和5%。（圖2B）。
圖2 降解MreB蛋白對細菌形態和PHA生產性能的影響
為了進一步增大細菌的體積，在CYL0212中過表達了minCD基因，MinCD蛋白與細胞分裂環的形成密切相關，其表達水平提高能抑制細胞分裂，使細胞變長。顯微鏡觀察結果顯示，過表達minCD確實進一步增大了橢球形細菌的體積（圖3A）。然而，在測量細胞干重和PHA含量后發現，這一操作顯著降低了細胞干重和PHA含量。因此，僅降解MreB的菌株被用于后續實驗（圖3B）。
圖3 通過過表達minCD進一步增大細胞體積，但降低干重和PHA含量
先前的研究表明，敲除PHA表面結合蛋白PhaP1會導致PHA顆粒發生融合，形成更大的顆粒，這有利于工業生產中的PHA提取過程。基于這一發現，他們在菌株CYL0212中敲除了phaP1基因，構建了工程菌株CYL0213，并利用透射電子顯微鏡對其內部的PHA顆粒進行了觀察（圖4A）。結果表明，當phaP1基因被敲除后，PHA顆粒的直徑從0.63微米增加至1.67微米（圖4B）。考慮到橢球形細菌體積的增大為其提供了更多空間用于PHA積累，他們在CYL0213中過表達了PHA合成相關基因phaAB，構建了工程菌CYL0307，與對照菌株相比，CYL0307的細胞干重從17.2g/L提高至20.8g/L， PHA含量從73.3%提高至78.4%（圖4C）。
圖4 通過敲除phaP1和過表達phaAB優化PHA的生產過程
接下來，他們將CYL0307用于7升、100升以及5噸發酵罐中進行PHA生產，以評估其在工業生產和提取過程中的性能表現。在PHA生產能力方面，結果顯示，工程菌CYL0307在不同規模發酵罐中的PHA產量均優于對照菌株。特別是在5噸發酵罐中，經過44小時發酵，CYL0307的細胞干重高達149g/L，PHA含量達到82%。而對照菌株在相同條件下干重僅為104g/L，PHA含量僅76%。在下游提取過程中，CYL0307也展現出多方面的優勢。首先，由于工程菌更大更重，其在發酵液中的沉降性能顯著增強，更易通過離心分離。在4000轉/分鐘的條件下，工程菌僅需離心4分鐘即可從發酵液中完全分離，而對照菌株則無法實現有效分離（圖5A）。其次，工程菌從桿狀轉變為球狀，細胞壁被延展，表面變得粗糙不平，這種結構變化說明細胞壁被破壞，從而可以更高效地提取胞內PHA顆粒。與對照菌株相比，工程菌在破壁過程中溶菌酶使用量減少了28%（圖5B和5C）。此外，通過掃描電子顯微鏡觀察發酵結束后的菌株的形態，并計算其體積，結果顯示，CYL0307呈現出球狀結構，體積較對照菌株增大九倍以上（圖5D和5E）。
圖5 球形菌的下游提取優勢
總結：本研究在非模式菌鹽單胞菌中開發了一種基于翻譯后修飾的蛋白質降解技術，實現了對目標蛋白MreB的可控降解。在此基礎上，通過敲除phaP1和過表達phaAB，成功使細菌體積增大九倍以上，并顯著提高了PHA的產量。此外，該技術還簡化了下游離心分離過程，并減少了溶菌酶的使用量，從而提升了PHA生產的效率和經濟性。文章第一作者為清華大學生命科學學院博士生陳翊苓，文章通訊作者為清華大學生命科學學院陳國強教授和吳瓊副教授。
鏈接地址：https://doi.org/10.1002/advs.202412256
陳國強教授簡介
陳國強，1994年被聘為清華大學副教授，1997－今聘為清華大學教授，2003－2009年兼任汕頭大學多學科研究中心主任。長期從事“生物合成PHA材料及其下一代工業生物技術”的研究。學術論文在Google Scholar引用4萬多次，H指數105。獲得授權專利70多項，50個公開專利。開發的PHA技術已經在數家公司用于大規模生產微生物塑料聚羥基脂肪酸酯PHA，使我國成為PHA領域國際上學術和產業最發達的國家、以及PHA醫學應用研究做多的國家，開發了多種PHA以及降解單體的多種應用。獲得的榮譽包括：國際生物聚合物（ISBP）工業獎（2024）；國際代謝工程獎（2023）、自然資源科學技術二等獎（2022）、全國先進科技工作者（2016）、候德傍化工創新獎（2015）、首屆閔恩澤能源化工杰出貢獻獎（2013）、談家禎生命科學創新獎（2011）、教育部長江學者特聘教授（2004）、教育部高校青年教師獎（2004）、第八屆中國青年科技獎（2003）、紐倫堡國際發明獎（2003）、茅以升科技獎（2003）、自然科學基金委國家杰出青年（2002）、 國家發明二等獎(排名第一)（2002）等。是973“合成生物學”項目以及國家重大專項項目的首席科學家、清華大學合成與系統生物學中心主任、英國曼徹斯特大學兼職講座教授。曾連續6年獲得清華大學學生“良師益友”的光榮稱號，進入清華大學“良師益友”名人堂。連續9年獲得清華大學高論文他引的“梅貽琦獎”。連續八年獲得Elsevier出版社生化與分子生物學高引用作者。學術服務：擔任國際期刊《Biotechnology Advances》和《Synthetic and Systems Biotechnology》主編，《生物工程學報》、《合成生物學》、《Journal of Biotechnology》 、《Microbial Cell Factories》、《Biotechnology Journal》和《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》副主編。另擔任國際學術期刊編委《Trends in Biotechnology》、《Current Opinions in Biotechnology》、《Metabolic Engineering》、《ACS Synthetic Biology》、《Microbial Biotechnology》、《Applied Microbiology and Biotechnology》、《Biomaterials》、《Biomacromolecules》和《Metabolic Engineering Communications》。
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