華理劉昌勝/屈雪、馬里蘭大學Gregory F. Payne AS：電分選策略構建組成/微結構雙梯度Janus引導骨再生膜
在組成/結構上具備異質性特征的生物材料能夠更靈活地定制局部特性，從而提供更為豐富的生物學功能，在醫學領域的需求越來越大。受控的異質性（如梯度）是生物系統中的普遍特征，其中包括分子類型或濃度的空間變化與形態結構的空間變化，例如孔徑和孔隙率。然而，目前能夠集成組分和微結構梯度特征的生物材料制造技術仍然十分缺乏。
近期，華東理工劉昌勝院士/屈雪教授團隊報道了一種電分選技術，利用殼聚糖與明膠分子的pH依賴的帶電特性誘導二者在電場作用下的差異化電泳和自組裝行為(即，在低pH條件下，殼聚糖與明膠分子均帶正電，同時向陰極電泳；中間pH條件，明膠發生電荷反轉，與帶正電的殼聚糖發生靜電相互作用；高pH條件，殼聚糖脫質子化自組裝，而帶負電的明膠分子被陰極排斥遠離電極)，實現明膠/殼聚糖均相混合物的組成分選，從而構建具有成分梯度（即，從殼聚糖的富集層到明膠的富集層）和可調節的致密/多孔梯度結構（孔隙率、孔徑以及致密層與多孔層的比率）的Janus薄膜，其在引導骨再生的應用中展示出多重功能：包括柔韌的機械性能，各向異性的界面潤濕性、傳質（定向生長因子釋放）和差異化細胞調控（防止成纖維細胞浸潤，促進成骨細胞生長和分化）等。總的來說，這項工作展示了電組裝在梯度化功能生物材料定制方面的巨大潛力。具體成果以 “Electro-Sorting Create Heterogeneity: Constructing A Multifunctional Janus Film with Integrated Compositional and Microstructural Gradients for Guided Bone Regeneration”發表在《Advanced Science》上。
【材料設計思路、制備及應用】
電組裝是一種新興的增材制造方法，它利用施加的電信號（通常< 5 V）引導電極表面（或附近）的材料組裝。電極施加的信號可以提供時空控制的線索來組裝具有成分和微觀結構控制的生物大分子材料。一方面，電場提供誘導帶電生物大分子鏈向指定電極遷移的提示，從而選擇性地從溶液中富集它們。另一方面，電極反應可以產生分子線索，可以誘導溶膠/凝膠轉變并生成分層組裝結構（例如，H2O2的陰極電解可以局部產生OH-離子），例如圖1a展示的電信號觸發的殼聚糖自組裝過程。在這項工作中，他們發現電子輸入可以“分選”明膠和殼聚糖的均勻雙組分混合物，從而形成集成組分和微觀結構梯度的Janus 薄膜。從組分上看，這種薄膜呈現出從富含殼聚糖的材料層到富含明膠的材料層的過渡。在結構上，這種薄膜呈現出從致密層到多孔層的梯度結構轉變，如圖1b所示。這項工作進一步證實了這種Janus薄膜在引導骨再生（GBR）中的多重功能：面對結締組織的薄膜富含殼聚糖且致密，提供了足夠的機械支撐，以防止薄膜塌陷并充當防止成纖維細胞侵入的屏障；面對骨缺損的薄膜富含明膠且多孔，為成骨細胞粘附、增殖和分化提供了適宜的微環境。此外，Janus薄膜的梯度結構賦予了薄膜柔韌的力學特性和各向異性的潤濕性，使手術操作順應性更高強。各向異性的多孔結構允許生長因子（BMP-2）的定向運輸，進一步強化骨再生，如圖1c所示。
圖1. (a) 電信號的輸入提供了控制殼聚糖電組裝的兩個線索：電解反應產生的pH線索誘導殼聚糖鏈去質子化和自組裝；電場信號誘導陽離子殼聚糖鏈遷移。(b) 電子輸入可以“分類”蛋白質明膠和多糖殼聚糖的均勻混合物，并提示具有成分和微觀結構集成梯度的Janus薄膜的出現。(c) 具有梯度特征的Janus薄膜作用于結締組織和骨之間的界面，使其在引導骨再生中發揮各種功能：富含殼聚糖的致密面提供機械支撐并且阻止成纖維細胞向內生長，而殼聚糖/明膠-多孔面促進成骨細胞生長和分化。
圖2. 殼聚糖/明膠的均勻混合物的電分選機制以及Janus薄膜的組分與微結構梯度的動力學形成過程。(a) 沉積過程中不同區域內殼聚糖與明膠分子鏈的相互作用及電分選機制：在低pH條件，殼聚糖與明膠分子均帶正電，互相排斥但同時向陰極電泳；中間pH條件，明膠發生電荷反轉，與帶正電的殼聚糖發生靜電相互作用；高pH條件，殼聚糖脫質子化自組裝，而帶負電的明膠分子被陰極排斥。(b)殼聚糖和明膠（均為 0.1% w/v）及其等比例混合物的Zeta電位的pH依賴性。 (c) ITC測量揭示了中間pH狀態下殼聚糖和明膠之間的吸熱相互作用（pH約為5；瓊脂用作非相互作用對照），以及 (d-e) 中間 pH 狀態下殼聚糖和明膠之間吸熱相互作用的比較pH (pH≈5) 和稍低的 pH (pH≈4) 表明相互作用隨著pH的降低而減弱。(f) 高分辨率橫截面熒光圖像和相應的圖像強度顯示了薄膜的成分梯度。(g) ATR-FTIR光譜顯示薄膜兩個面之間的成分差異。流體通道內 (h) 殼聚糖/明膠混合物和 (i) 殼聚糖的動力學組裝過程的原位觀察。所得 (j) 明膠-殼聚糖膜兩個表面和橫截面的SEM圖像及其光學外觀。(l) 用于原位觀察的流體通道裝置示意圖。
圖3. Janus 殼聚糖/明膠薄膜的機械性能和表面潤濕性。(a) 光學圖像證明了Janus薄膜的柔韌性（殼聚糖/明膠比例為6/4；電組裝參數為6.67 mA/cm2 1000秒）：濕膜可以扭曲（打結和解開成結），干膜可以折疊成緊湊的星形結構。(b)通過液滴對干膜的致密ElecFace或多孔SolcFace進行潤濕。(c) 動態水接觸角測量表明，多孔SolcFace促進液體擴散，而致密ElecFace則呈現疏水性。(d) 干膜的致密ElecFace和多孔SolcFace與濕豬皮表面的貼敷能力不同。
圖4. Janus 薄膜的單向釋放功能評價。(a) 將模型蛋白牛血清白蛋白 (BSA) 加載到 Janus 膜的多孔層中并測量其方向依賴性釋放的圖示。(b) BSA釋放到擴散池兩個隔室中的圖像； i) Janus Chit/Gelatin膜；ii)通過流延和冷凍干燥制備的多孔Chit/Gelatin對照膜；iii) 通過流延制備的致密Chit/Gelatin對照膜（注：將考馬斯亮藍 G250 添加到兩個室中的溶液中以方便觀察）。(c) 實時觀察 BSA 從薄膜釋放到兩個室溶液中的情況 (n = 4)，從上圖可以看出，BSA可以被Janus Chit/Gelatin膜定向緩釋。
圖5. Janus Chit/Gelatin薄膜的纖維細胞屏障功能以及分別具有Janus結構和致密結構的Chit/Gelatin薄膜負載骨形態發生蛋白（BMP-2）后的大鼠顱骨缺損模型中引導骨再生的評價。(a) 實驗方法，其中細胞冠插入物用交聯膜（致密面朝上或多孔面朝上）密封并放置在孔板上以隔離上部和下部體積以評估各向異性細胞引導。(b) 3D 熒光圖像顯示Janus膜的致密層可以屏障L929成纖維細胞。(c) 術后8周拍攝的治療后顱骨缺損的顯微 CT 成像；(d) 8周修復期后不同組中新形成骨的Van Gieson染色結果與礦化的熒光標記組織結果（紅色，4-6 周；綠色，6-8 周）。
本工作展示了電信號調控生物大分子各向異性組裝的巨大潛力。施加的電信號可用于對多組分生物大分子進行分類，以創建具有成分和結構梯度的高性能生物材料。論文的第一作者為華東理工“博新計劃”獲得者雷淼博士后，華東理工碩士研究生廖海濤為論文共同第一作者。論文第一單位為華東理工大學。該研究工作得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金，111計劃，上海市優秀學術帶頭人項目，上海市揚帆計劃及中國博士后科學基金會等項目的資助。特別鳴謝美國馬里蘭大學Gregory F. Payne教授以及華東理工大學王詩佳碩士對本研究的杰出貢獻。
原文鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.202307606
