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  近日，中比先進(jìn)生物醫(yī)用材料聯(lián)合實驗室（南京林業(yè)大學(xué)-根特大學(xué)）熊燃華教授，Stefaan C. De Smedt院士及Kevin Braeckmans教授在Nature Communications上在線發(fā)表了題為“Light triggered nanoscale biolistics for ef?cient intracellular delivery of functional macromolecules in mammalian cells”（DOI: 10.1038/s41467-022-29713-7）的研究型論文。他們開發(fā)了一種新型納米粒表面荷載納米彈丸的“納米炸彈”，揭示了其與光協(xié)同生成納米微泡“推動”生物大分子進(jìn)入胞內(nèi)的高效遞送機制，顯著提高了大粒徑生物大分子（如mRNA、pDNA）的遞送效率，實現(xiàn)了高通量、高效的胞內(nèi)遞送。中比先進(jìn)生物醫(yī)用材料國際聯(lián)合（南京林業(yè)大學(xué)-根特大學(xué)）實驗室熊燃華教授、Stefaan C. De Smedt院士和Kevin Braeckmans教授為通訊作者。

  向活細(xì)胞內(nèi)遞送功能生物大分子是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個重要研究方向，例如，細(xì)胞免疫療法需要在體外通過胞內(nèi)遞送技術(shù)，將生物大分子如核酸等遞送到細(xì)胞內(nèi)，得到功能免疫細(xì)胞；然后將其回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，實現(xiàn)免疫細(xì)胞對癌細(xì)胞產(chǎn)生特異性識別，達(dá)到精準(zhǔn)殺傷癌細(xì)胞的目的。然而，生物大分子向胞內(nèi)遞送過程需要克服細(xì)胞膜造成的系列障礙如細(xì)胞攝取、胞內(nèi)釋放等。傳統(tǒng)的胞內(nèi)遞送方法難以兼顧細(xì)胞處理通量、遞送效率、遞送安全等問題。因此，如何創(chuàng)建高通量、高效、安全的生物大分子胞內(nèi)遞送新材料及技術(shù)是需要解決的關(guān)鍵科學(xué)問題，對生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展具有重要的意義。

  光作用的胞內(nèi)遞送方法具有較好的通用性和調(diào)控性，尤其適用于在離體情況下遞送各種生物大分子到各類細(xì)胞內(nèi)。將激光束聚焦于細(xì)胞膜，可在細(xì)胞膜上短暫地形成微小膜孔，生物大分子通過膜孔自由擴(kuò)散進(jìn)入胞內(nèi)，實現(xiàn)胞內(nèi)遞送過程。然而，如何將光束“手動”聚焦到僅有幾納米厚的細(xì)胞膜上，并形成幾百納米范圍的膜孔異常困難，實驗操作的復(fù)雜性極大限制了細(xì)胞處理通量和該方法的進(jìn)一步應(yīng)用。為了解決這一難題，他們提出了納米粒與光協(xié)同增強胞內(nèi)遞送的方法，通過黏附在細(xì)胞上的納米粒將光協(xié)同效應(yīng)“自動”聚焦于細(xì)胞膜，進(jìn)行高通量的快速精準(zhǔn)“開孔”，局部增強細(xì)胞膜滲透性，將細(xì)胞處理通量從每分鐘數(shù)十個顯著地提高到每分鐘百萬個，實現(xiàn)了高通量的胞內(nèi)遞送。他們利用具有良好細(xì)胞黏附能力的陽離子聚合物與光吸收功能較好的納米顆粒（如納米金、石墨烯量子點、黑磷量子點等）之間的相互吸附效應(yīng)，制備了一系列改性光吸收納米顆粒。首先，將陽離子聚二烯二甲基氯化銨修飾在金納米顆粒表面，制備了具有良好細(xì)胞黏附性的金納米粒；發(fā)現(xiàn)在強激光能量密度協(xié)同作用下，金納米粒迅速吸收光能轉(zhuǎn)化成熱能，誘導(dǎo)生成納米微泡并在細(xì)胞膜上高通量地快速精準(zhǔn)“開孔”，細(xì)胞外的生物大分子通過“膜孔”滲透到細(xì)胞內(nèi)，從而實現(xiàn)胞內(nèi)遞送過程。該遞送策略不僅保障了細(xì)胞的高通量處理，而且將小干擾核酸（siRNA）遞送效率從傳統(tǒng)熱作用的40%提高到80%，顯著增強了抑制蛋白表達(dá)的生物功能（ACS Nano，2014，8，6288–6296）。

  為了促進(jìn)納米粒與光協(xié)同增強的胞內(nèi)遞送技術(shù)向臨床應(yīng)用快速轉(zhuǎn)化，應(yīng)避免納米粒與細(xì)胞直接接觸導(dǎo)致納米粒“侵入”細(xì)胞。針對該難題，他們提出了聚合物薄膜“錨定”納米粒的設(shè)計策略，即通過旋涂成型工藝將納米粒嵌入聚合物薄膜內(nèi)，再與光協(xié)同引發(fā)納米微泡效應(yīng)，促進(jìn)黏附或生長在薄膜上的細(xì)胞產(chǎn)生局部精準(zhǔn)破膜，增強細(xì)胞滲透性，實現(xiàn)納米粒“非侵入”細(xì)胞的安全胞內(nèi)遞送（Adv. Mater., 2021, 33, 2008379）。然而，基于旋涂工藝制備的“實體”聚合物薄膜的膜內(nèi)孔隙率低、孔徑小，可能會限制功能生物大分子的胞內(nèi)遞送效率。基于他們近年來在靜電紡絲領(lǐng)域積累的研究成果，進(jìn)一步提出了靜電紡絲納米纖維“錨定”納米粒的新策略，創(chuàng)建了復(fù)合納米纖維膜與光協(xié)同增強且納米粒“非侵入”細(xì)胞的胞內(nèi)遞送新方法，不僅顯著地將免疫T細(xì)胞的siRNA胞內(nèi)遞送效率從10%提高至40%，而且同時保證了免疫細(xì)胞的生物功能特性完好無損，為難以兼顧處理通量、效率、安全的胞內(nèi)遞送難題提供了有效解決方法（如圖1，Nat. Nanotechnol., 2021, 16, 1281）。具體地，利用靜電紡絲技術(shù)制備了內(nèi)嵌四氧化三鐵光敏納米粒的聚己內(nèi)酯（PCL）復(fù)合納米纖維膜。在生物大分子遞送過程中，分散在溶液中的大分子可在高孔隙率、大孔徑的納米纖維薄膜中迅速擴(kuò)散，極大提高了大分子在細(xì)胞膜局部破膜處的濃度，從而提高了遞送效率。同時，質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)處理后的細(xì)胞體內(nèi)鐵元素含量與對照組無顯著差別，證明了該過程是納米粒“非侵入”細(xì)胞內(nèi)的安全遞送。通過遞送siRNA功能化的免疫T細(xì)胞，在免疫缺陷小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出顯著的腫瘤抑制效果。

  為了提高大粒徑生物大分子如信使核糖核酸（mRNA）、質(zhì)粒脫氧核糖核酸（pDNA）的胞內(nèi)遞送效率，他們進(jìn)一步提出了復(fù)合納米粒與光協(xié)同生成納米微泡“推動”生物大分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的遞送新思路，與傳統(tǒng)依靠分子“被動擴(kuò)散”進(jìn)入細(xì)胞的遞送方法相比，發(fā)現(xiàn)mRNA、pDNA胞內(nèi)遞送效率分別顯著提高了約6倍和8倍（如圖2）。

圖2  復(fù)合納米粒與光協(xié)同生成納米微泡“推動”生物大分子進(jìn)入胞內(nèi)的遞送示意圖

  具體地，通過在納米粒表面荷載納米彈丸，合成了一種新型復(fù)合納米粒結(jié)構(gòu)的“納米炸彈”；在光協(xié)同作用下，納米粒快速吸收光能轉(zhuǎn)化成熱能，誘導(dǎo)生成納米微泡，形成“爆炸”推力，推動其表面荷載的納米“彈丸”局部穿破細(xì)胞膜，但該局部破膜作用尚不會對細(xì)胞的主體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生整體影響，從而安全地“推動”分散在溶液中的生物大分子進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，實現(xiàn)高通量、高效的生物大分子胞內(nèi)遞送。

圖3  由四氧化三鐵核納粒和200 nm聚苯乙烯納米球組成的200-“納米炸彈”的合成、表征和激光引發(fā)。  

圖4  200-“納米炸彈”激光引發(fā)及其與細(xì)胞相互作用的實驗和理論研究。  

圖5  應(yīng)用200-“納米炸彈”向貼壁細(xì)胞HeLa和懸浮細(xì)胞Jurkatm胞內(nèi)遞送功能生物大分子RNA和pDNA。

  全文鏈接： https://doi.org/10.1038/s41467-022-29713-7

  實驗室主頁：https://www.x-mol.com/groups/nfu-ugent