程忠玲1,2，王松1，朱鶴孫1
(1. 北京理工大學材料科學研究中心，北京100081；2. 承德石油高等專科學校化工系，河北承德067000)
Preparation and blood anticoagulant activity of heparinized collagen/silk fibroin blend film
CHENG Zhong-ling1,2, WANG Song1，ZHU He-sun1
(1. Research Center of Material Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China;
2. Department of Chemical Engineering, Chengde Petroleum College, Chengde 067000, china)
Abstract：The blend film was prepared by blending the heparinized collagen and aqueous of silk fibroin, and glutaraldehyde was used as a coupling agent in order to enhance its mechanical properties of blend film. The blend film in vitro blood anticogulant activity was assessed by activated partial thromboplastin time (APTT), activated thromboplastin time (PT), thrombin time (TT) measurement. The combination rate approached the optimum of 56% and the rupture strength was 45MPa as glutaraldehyde mass concentration was 5g/L.Experiments were done to determine APTT, TT, PT. APTT, TT, PT of blend film was excess 150, 200 and 50s respectively.
Key words：collagen；silk fibroin；heparinize；anticoagulant activity
摘要：將肝素化膠原與絲素溶液共混，制備了肝素化膠原/絲素共混膜，并采用戊二醛作為交聯劑，以提高共混膜的機械性能。共混物的體外抗凝血活性采用部分凝血活酶時間(APTT)、凝血活酶時間(PT)、凝血酶時間(TT)來評價。當戊二醛的質量濃度為5g/L時，肝素的結合率為56%，共混膜的斷裂強度為45MPa。APTT、TT、PT凝血時間實驗證明，共混膜的APTT、TT、PT分別超過150、200和50s。
關鍵詞：膠原；絲素；肝素化；抗凝血性
中圖分類號：O636.9 文獻標識碼：A
文章編號：1001-9731（2004）增刊-2484-03
1 引言
利用肝素化來提高材料的抗凝血性研究始于20世紀60年代。最先通過離子鍵使材料表面肝素化的途徑是Gott提出的GBH方法,而近年來采用離子鍵固定肝素主要是利用大分子主鏈或側鏈季胺化再肝素化的方法。本文選用酶法制備的膠原作為固定肝素的載體，是因為膠原是一種天然生物材料，生物相容性好，在酸性條件下膠原中帶正電的氨基基團可與肝素中帶負電的硫酸基團相互作用，以離子鍵結合形成肝素化膠原復合物[1]。為解決酶法制備的膠原存在機械性能差，溶漲性大的弱點，在肝素化膠原中加入另一種成膜性較好的天然纖維蛋白質——絲素蛋白，以解決肝素化膠原的溶漲問題，并加入戊二醛（GA）為共混膜的交聯劑，GA可與蛋白質形成交聯結構，蛋白質之間通過穩定的碳氮共價鍵的搭橋而緊密結合在一起，其穩定性和力學性能大大提高[2]。體外抗凝血實驗APTT、TT、PT表明，該共混膜具有良好的抗凝血性能，從而得到一種性能優良的新型生物醫用復合膜。
2 實驗
2.1 絲素蛋白溶液的制備
蠶絲用0.5%NaCO3水溶液煮沸30min,精練2次，精煉后用蒸餾水充分洗凈，自然干燥得到脫膠絲素纖維。然后用氯化鈣∶乙醇∶水=1∶2∶8（摩爾比）的溶劑在80℃下溶解絲素纖維。將溶解得到的絲素溶液倒入纖維素透析膜中，分別在水、蒸餾水中透析72 h，濾去雜質，得絲素水溶液。用紫外吸收法測定濃度。
2.2 肝素化膠原的制備
豬皮在0.5g/L的NaOH溶液中浸泡過夜，脫脂后在pH=3條件下，用適量的胃蛋白酶和青霉素酶解4d，當降解物成膠狀后，用0.5g/L的NaOH溶液調至pH=10，并放置于4℃冰箱中使胃蛋白酶失活。然后采用等電點沉淀法調節pH=6~7使膠原沉淀，冷凍離心分離、純化，然后在0.1g/L的醋酸溶液和蒸餾水中分別透析3d，冷凍干燥得膠原。將50mg膠原在0.2g/L的醋酸溶液5mL中于50℃溶解后，向其內滴加10g/L的肝素溶液0.5mL，均勻攪拌10min,得到肝素化膠原。結構表征采用EQINOX55型紅外光譜儀進行紅外掃描。
2.3 肝素化膠原/絲素共混膜的制備
將肝素化膠原與絲素溶液共混（膠原/絲素的質量比為1/4），加入戊二醛作交聯劑，混合并緩慢攪拌，靜置脫泡，注入聚乙烯模具內，在25℃、相對濕度為65%的環境下干燥72h成膜。
2.4 肝素結合率的測定[3]
2.4.1 肝素標準曲線的繪制
將25mg甲苯胺藍溶于500ml含有0.49ml的37%HCl和1g NaCl的去離子水中，得到0.05g/L的甲苯胺藍溶液。用進樣器量取3ml已知濃度的肝素水溶液于試管中，加入3ml甲苯胺藍溶液，充分振蕩混勻，然后加入3ml正己烷后振蕩混合使其分相，讀取下層水相在631nm處的吸光度，以肝素含量（μg）為x軸，631nm吸光度為y軸，繪制標準曲線。
2.4.2 肝素結合率的測定
將肝素化的共混膜浸入15ml水中，5天測試一次浸泡液中肝素的溶出量，方法為量取3ml已定容的浸泡液于試管中，其它試劑的加入同1.5.1方法，測其吸光度，對照標準曲線，讀出相應肝素的量，直至浸泡液中的肝素溶出量為零。按結合在共混膜中的肝素量來計算肝素結合率。
2.5 膜的機械性能測定
將膜裁成10mm×60mm的樣條，用TOM500J型萬能引張壓縮機測定膜的拉伸強度,拉伸速度100mm/min,負載5㎏，每組3個樣品，取其平均值。
2.6 體外抗凝血活性評價
體外抗凝血活性評價，采用體外凝血時間試驗，包括APTT、TT、PT 3種凝血時間測定。將試樣置于比色杯中，在健康人血漿中溫育一定時間，加入測定APTT、TT、PT所需的各種酶反應試劑，引發血栓的形成。APTT、TT、PT3種凝血時間測定采用COAG-A-MATE-XM型半自動四通道凝血儀，按使用說明測定。
3 實驗結果與分析
3.1 肝素化膠原/的形成
膠原是由三股α-肽鏈相互擰成的纖維狀蛋白質，膠原蛋白分子是由多肽鏈作螺狀纏繞而成的繩索狀大分子，每條多肽鏈約含1030個氨基酸殘基，由于氨基酸中含有酸性的羧基和堿性的氨基,羧基可以把質子轉移到堿性的氨基上，在同一分子上產生一個正電荷和一個負電荷，使氨基酸成為偶極離子，常常以兩性離子的形式（－NH3+ 和COO - ）存在[4]。肝素（a）、復合物（b）、膠原（c）的紅外光譜見圖1。從復合物的紅外光譜圖1（b）中可以看出，1652（酰胺I）、1538（酰胺II）、1240（酰胺III）和565cm-1（酰胺V）是膠原相應酰胺的特征峰，在850cm-1處出現新峰，為復合物的硫酸基團C－O－S伸縮振動峰，由于肝素的硫酸基與膠原中帶正電氨基形成了離子鍵，使其從820 cm-1（肝素的硫酸基位置）移到了850 cm-1。
3.2 肝素的結合率
3.2.1 肝素的標準曲線
采用甲苯胺藍染色法測定肝素的含量。肝素可以與甲苯胺藍形成復合物而使溶液中甲苯胺藍含量有所下降，加入非極性有機溶劑如正己烷進行抽提，將肝素-甲苯胺藍復合物抽提到有機相中。通過檢測溶液在一定波長（甲苯胺藍的特征吸收波長通常為631nm）處吸光度的下降便可求得所測肝素量。圖2為肝素在631nm處的標準曲線。
3.2.2 戊二醛質量濃度對共混膜的肝素結合率的影響
戊二醛質量濃度對共混膜的肝素結合率的影響，結果見圖3。未用戊二醛交聯的肝素化膠原/絲素共混膜的肝素結合率為32%，加入戊二醛后，肝素結合率隨戊二醛的質量濃度增加而增加，當戊二醛的質量濃度增加到5g/L時，肝素結合率達到56%，以后隨著戊二醛用量的進一步增加，稍微出現下降的趨勢。
3.3 膜的機械性能
測定不同質量濃度戊二醛交聯的共混膜的機械性能，結果見表1。從共混膜的機械性能考慮，戊二醛不宜多加，因為戊二醛濃度較大時，與絲素、膠原上的—NH2會產生過度交聯，使共混膜變黃、變脆，浸泡20天后膜已破碎，無法測定其機械性能。未用戊二醛交聯的共混膜也出現相同的情況。因此，綜合考慮以5g/L戊二醛進行交聯為佳。
3.4 體外抗凝血性能評價
將綜合性能較好的肝素化膠原/絲素共混膜進行體外凝血時間APTT、TT、PT測定，并與健康人血漿進行對照，各重復3次，取其平均值，結果如表2所示。
正常人血的凝血時間分別為：PT：(11±3)s；APTT：(28±10)s；TT：(16±5)s。表2數據表明，所采集的血漿樣品的凝血時間在正常范圍之內。通過測定膠原/絲素膜與血漿接觸后的凝血時間可以看出，未經肝素化處理的絲素/膠原膜的凝血時間與空白血漿的凝血時間相比變化不大。而經肝素化后的膠原/絲素膜表現出優異的抗凝血性能，3種凝血時間APTT、TT、PT都超出了儀器的設定范圍，表明固定在膠原/絲素膜中的肝素仍保持良好的生物活性，有效地提高材料的抗凝血性。
4 結論
將肝素化膠原與絲素共混，以戊二醛為交聯劑，制備的共混膜中肝素的結合率及其機械強度與交聯劑的質量濃度有關，當戊二醛的質量濃度為5g/L時，共混膜的肝素結合率為56%，斷裂強度為45MPa，凝血時間APTT、TT、PT分別超過150、200和50s。
參考文獻：
[1] 朱鶴孫. 醫用與口腔材料. [M]. 北京: 科學出版社, 1999, 5.
[2] 李天全. [J]. 生物醫學工程雜志, 1998, 5(2): 118-124.
[3] Ducan AC, Boughner D, Campbell G. [J]. European Polymer Journal, 2001, 37: 1821-1826.
[4] 胡建芳, 錢露西, 郭淑靜, 等. [J].材料研究學報, 1994, 8(1): 82-87.
基金項目：國家重點基礎研究（973）計劃項目（G1999064705）
作者簡介：程忠玲（1969—），女，山東榮成人，講師，承德石油高等專科學校教師，主要從事抗凝血材料的研究。（E-mail: czl1969.student@sina.com），Tel: 010-68949661。
論文來源：中國功能材料及其應用學術會議,2004年,9月12-16日
