浙江大學張鵬研究員 Nat. Commun.：具有內在抗異物反應能力的免涂層免疫相容彈性體
可植入生物材料和生物醫學器件植入后所引起的異物反應（Foreign Body Response, FBR）會嚴重阻礙其功能，甚至導致失效。對于彈性體基材來說，開發生物相容性表面涂層是目前廣泛接受的抗異物反應方法，但其應用仍面臨若干挑戰。首先，具有持久抗異物反應性能的材料依然稀缺，有些材料需要復雜的化學合成和純化過程。其次，復雜的涂層工藝不適合大規模工業生產。第三，不均勻的涂層應用和覆蓋不足進一步影響效果。最后，在復雜的生理環境中，涂層脫落的問題也構成重大挑戰。克服植入彈性體材料的異物反應，開發具有高度免疫相容性的生物材料仍是一個艱巨的任務。
圖1 商用PDMS彈性體與EVADE彈性體的外觀與化學結構
近期，浙江大學高分子科學與工程學系張鵬研究員開發了一類免疫相容的免涂層彈性體材料，稱為EVADE彈性體。EVADE 材料在嚙齒動物的皮下模型中有效抑制了炎癥和纖維囊形成長達一年，在非人類靈長類動物的皮下模型中達到兩個月。與聚二甲基硅氧烷（PDMS）相比，EVADE 材料的植入顯著降低了鄰近組織中與炎癥相關的蛋白質 S100A8/A9 的表達。他們還發現，抑制或敲除 S100A8/A9 可以顯著減輕小鼠的纖維化，表明這是一個抑制纖維化反應的新靶點。由 EVADE 彈性體制成的持續皮下胰島素輸注（CSII）導管在耐久性和性能上顯著優于商業導管。這里所報告的 EVADE 材料有望通過抵抗局部免疫反應來增強和延長各種醫療設備的功能。這項研究突破了在彈性體表面構建免疫相容性涂層的傳統方法，揭示了抵抗纖維化反應的新靶點，為可植入醫療器械的免疫相容性材料提供了全新的選擇。該工作以“Immunocompatible elastomer with increased resistance to the foreign body response”為題發表在《Nature Communications》上（Nat. Commun. 2024,15, 7526）。文章第一作者是浙江大學博士生周咸池。該研究得到國家自然科學基金委的支持。
圖2 EVADE彈性體在小鼠皮下植入一個月后所引發的纖維化反應評估
EVADE材料基于四氫吡喃醚衍生的甲基丙烯酸酯免疫調節單體HPEMA（圖1）。該單體易于合成，并能通過自由基聚合反應實現聚合。為了在聚合物結構中引入物理可交聯的部分，他們將HPEMA與丙烯酸十八酯（ODA）共聚。ODA具有長烷基鏈，可以在共聚物中形成微晶，從而實現物理交聯。共聚物通過本體聚合制備，并以HPEMA的摩爾分數命名。例如，由90 mol% HPEMA和10 mol% ODA組成的共聚物被命名為H90。
他們選擇了三個樣品 H50、H70 和 H90 ，進行進一步的體內植入測試，以評估它們的纖維化反應，并與常用醫用彈性體 PDMS 進行比較。實驗中，他們對 C57BL/6 小鼠進行了皮下植入，每只小鼠的背部植入了所有四個樣品。經過一個月的植入期后，他們取出了彈性體片。代表性的照片和組織學圖像見圖2。組織學染色（包括 Masson 三色染色和蘇木精-伊紅 (H&E) 染色）顯示，EVADE 材料（特別是 H90）形成了厚度為 10 至 40 微米的纖維化囊，而 PDMS 植入物的纖維化囊厚度則為 45-135 微米。我們還將 H90 與其他四種常用的生物醫用可植入聚合物進行比較，分別是乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物 (EMA)、熱塑性聚氨酯（TPU）、聚烯烴彈性體 (POE) 和聚酰胺 (PA)。如圖2所示，植入 H90 后幾乎未形成任何纖維囊，而其他所有材料均形成了 35 至 160 微米厚的纖維化包膜。這表明 EVADE 材料具有優異的免疫相容性。
圖3 EVADE彈性體在小鼠皮下植入兩周后所引發的炎癥反應評估
他們研究了 EVADE 材料在 C57BL/6 小鼠皮下植入兩周后引發的急性炎癥反應，觀察到 H90 僅引起非常微弱的炎癥反應。首先，他們通過免疫組織化學切片分析了促炎標志物 CCR-7、TNF-α 和 IL-6 以及抗炎標志物 IL-10，以評估彈性體植入對周圍組織炎癥水平的影響（如圖 2a）。結果顯示，PDMS 顯著增加了彈性體與組織界面處的炎癥標志物，而 EVADE 材料的炎癥標志物表達明顯較低，其中 H90 的表現最為顯著（約為 PDMS 彈性體周圍組織中觀察到的 1/6 到 1/8）。盡管如此，抗炎標志物 IL-10 的表達在 EVADE 和 PDMS 彈性體之間沒有顯著差異。接著，他們提取了植入物周圍的細胞，并進行了單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 分析，以檢查免疫細胞的組成和基因表達（如圖 2b）。通過單細胞轉錄組的 k 均值聚類分析，他們識別出八種細胞類型中的三個主要簇：巨噬細胞、樹突狀細胞和 T/自然殺傷細胞。基因分析表明，H90 的植入引發了免疫細胞中炎性細胞因子、趨化因子和集落刺激因子的廣泛下調。
圖4 皮下植入后24小時，從回收的彈性體表面提取的蛋白質裂解物的蛋白質組學分析
蛋白質吸附是異物反應過程中至關重要的初始步驟，研究植入物植入早期后表面蛋白質的吸附情況，有助于深入了解EVADE材料降低異物反應的機制。他們通過蛋白質組學鑒定了植入后24小時吸附在H90和PDMS表面的蛋白質種類（圖3）。結果顯示，在24小時內，白蛋白是 PDMS 和 H90 材料表面吸附量最大的蛋白質。在 PDMS 表面，炎癥相關蛋白 S100A8 和 S100A9 的比例較高，分別為 7.2% 和 13.1%，而在 H90 表面的吸附量則顯著較低，分別為 3.5% 和 7.4%。這些結果表明，S100A8/A9 蛋白的表達和吸附可能會加劇炎癥反應，進而促進體內 FBR 的發生。
圖5 S100A9藥物抑制模型與S100A8基因敲除模型的構建與纖維化反應評估
盡管大量研究支持 S100A8/A9 蛋白在炎癥反應中的作用，但尚無直接證據表明抑制這些蛋白的表達可以減輕植入物的異物反應。基于結果，他們假設抑制 S100A8/A9 表達可能有助于降低植入物的異物反應。為驗證這一假設，他們首先測試了S100A9 抑制劑 tasquinimod (TAS) 對 PDMS 片的纖維化反應。TAS 是一種口服活性喹啉-3-甲酰胺，具有與組蛋白去乙酰化酶 4 (HDAC4) 和 S100A9 高親和力的結合。在 PDMS 植入后 30 天內，通過每日飲用水向小鼠提供兩種劑量的 TAS（1 mg/kg 和 3 mg/kg）（見圖 4a-c）。Masson 切片顯示，TAS 組 PDMS 周圍的膠原沉積明顯減少，纖維囊厚度約為未施用 TAS 時觀察到的 1/2 至 1/3 倍，表明PDMS片的異物反應得到抑制。此外，他們還構建了 S100A8 敲除 (KO) 小鼠模型，通過將 Floxed-S100A8 轉基因 (Tg) 小鼠與 LysM-Cre Tg 小鼠雜交（見圖 4d-f）。將 PDMS 圓盤植入皮下一個月后，組織學結果顯示，S100A8 敲除的小鼠中幾乎觀察不到纖維化囊形成。綜上所述，這些發現表明 S100A8/S100A9蛋白在材料植入后的纖維化過程中起著關鍵作用，降低這些蛋白的表達可以有效減輕材料誘導的異物反應。
圖6 小鼠長期植入模型與非人靈長類植入模型驗證
生物材料抵抗長期纖維囊形成的能力對維持體內植入裝置的功能至關重要。為評估這一點，他們進行了為期一年的植入研究，并在十二個月后取回彈性體樣品進行纖維化評估。所有 H90 彈性體樣品均顯示出清晰的輪廓，并被較薄的纖維囊包圍，如數碼照片和 M&T 染色所示（見圖 5a）。相比之下，對照的 PDMS 彈性體在植入后形成了厚厚的膠原層，植入十二個月后完全被覆蓋。為了將這些發現擴展到更高級的物種，他們在健康的食蟹猴皮下植入了 H90 和 PDMS 彈性體片（見圖 5b）。兩個月后取出植入物并進行分析。Masson 三色染色顯示，PDMS 樣品中存在顯著的纖維化反應（最多 180 μm），而 H90 的膠原層較薄（最多 60 μm）。值得注意的是，在兩只實驗猴中沒有觀察到纖維化包裹現象。
圖7 EVADE彈性體制成的胰島素輸注導管在糖尿病小鼠體內保持了長期功能
他們進一步開發了由 EVADE 材料制成的輸注導管，并在糖尿病小鼠模型中評估了它們在標準泵治療條件下的性能（見圖 6）。EVADE 輸注導管被植入小鼠皮下并用粘合劑固定，同時市售的 Silhouette 導管作為對照。為了測試 EVADE 導管在自然微運動下的表現，他們將導管連接到輸注管線，并讓小鼠攜帶輸注器長達 7 天。隨后，將導管連接到胰島素泵（Medtronic MiniMed 722）以評估在持續胰島素輸注期間的功能。小鼠以 10 μL/h 的速率接受持續基礎胰島素輸注，并每次進行 45 μL 的胰島素推注（見圖 6b）。植入后第 7 天，通過胰島素泵進行了推注輸注的胰島素吸收試驗。與標準皮下（SC）注射相比，通過 Silhouette 導管輸送的胰島素吸收延遲了 0.5-1 小時，而通過 EVADE 導管輸送的胰島素則表現出與 SC 注射一致的藥代動力學特征（見圖 6c-e）。因此，EVADE 輸注器產生的血糖效應與傳統的 SC 胰島素注射相當，這通過給藥后 1 小時的最低血糖水平得以體現。相對而言，Silhouette 輸注器表現出明顯的藥理作用延遲，最低血糖水平比 EVADE 組晚 0.5-1 小時。這些發現凸顯了 EVADE 材料通過減少局部免疫反應來改善植入式生物醫學設備體內性能的潛力。
該工作是該團隊近期在免疫相容性材料研究方面的最新進展之一。傳統的可植入生物材料和醫療器械在植入后常常引發強烈的異物反應，這會對器械的功能產生極大影響。為應對這一挑戰，團隊發展了一系列免疫相容材料和表面修飾方法，系統探索了植入材料的化學結構與免疫相容性之間的關系，并揭示了全新的抗纖維化生物靶點。在過去的一年中，團隊開發了一系列基于兩性離子材料的免疫相容水凝膠材料（Adv. Sci., 2024, 11, 2308077; Biomater. Sci., 2024, 12, 468）、免疫相容彈性體材料（Acta Biomater., 2024, DOI: 10.1016/j.actbio.2024.06.047）以及基于天然白蛋白的免疫相容表面改性方法（Bioact. Mater., 2024, 34, 482）。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-52023-z
