基因傳遞的成功依賴于高效無毒的載體。病毒載體的免疫原性或致癌性大大限制了其在基因傳遞中的應用，而非病毒載體如線性陽離子聚合物、聚乙烯亞胺（PEI）、聚酰胺-胺（PAMAM）或聚丙烯亞胺樹狀大分子、陽離子脂質體和陽離子多肽等由于其低毒性而受到研究者的青睞。這些非病毒載體可通過靜電作用與帶負電荷的基因形成結構緊湊的、帶正電荷的復合物，進而實現基因的有效傳遞。
在眾多的非病毒載體體系中，具有生物相容性骨架的含磷樹狀大分子已被應用于生物醫學領域，如抗朊病毒藥物、抗HIV藥物和人自然殺傷細胞激活劑等。基于含磷樹狀大分子的研究現狀，東華大學史向陽教授團隊和法國國家科學研究中心Jean-Pierre Majoral教授團隊合作設計構建了不同代數的、不同環胺封端的陽離子型含磷樹狀大分子（Cationic Phosphorus Dendrimers, CPD），并深入系統地研究了其在基因傳遞及腫瘤治療方面的應用。合作團隊以環三聚磷腈為核，通過層層修飾的方法合成了不同代數的含磷樹狀大分子，外圍通過取代反應修飾吡咯或哌啶環并質子化，最終制備得到了陽離子型含磷樹狀大分子（圖1）。
圖 1. 陽離子型含磷樹狀大分子的合成示意圖
首先，研究團隊以編碼增強型綠色熒光蛋白的質粒（pDNA-EGFP）為報告基因，研究了CPD/pDNA-EGFP的細胞毒性及其基因傳遞效率。實驗結果顯示，所有的CPD/pDNA-EGFP復合物在給定濃度范圍內均表現出良好的細胞相容性。在相同條件下，表面修飾1-（2-氨基乙基）吡咯烷并質子化的第一代含磷樹狀大分子（1-G1）對HeLa細胞的基因傳遞效率最佳（圖2）。
圖 2. CPD/pDNA復合物的（A）水合粒徑和（B）表面電勢；（C-G）不同濃度下CPD及其pDNA復合物的細胞毒性測試（以HeLa細胞為模型）；（H） CPD/pDNA-EGFP復合物基因轉染示意圖（以1-G1為例）；（I）流式細胞術檢測不同N/P比條件下CPD/pDNA-EGFP復合物在HeLa細胞中EGFP（增強綠色熒光蛋白）的相對表達量。
為了更進一步的探索CPD在基因治療中的應用，研究團隊以篩選后得到的1-G1作為載體，轉染同時編碼EGFP和p53蛋白的質粒（pDNA-p53），用于腫瘤細胞的基因治療。流式細胞術結果顯示，在優化的條件下，HeLa細胞經1-G1/pDNA-p53處理后，其細胞周期發生明顯改變。與此同時，實時定量PCR及蛋白質印跡結果也表明，1-G1/pDNA-p53實驗組中p53的mRNA和蛋白表達量有明顯升高；同時p53的下游調控基因p21及細胞周期調控因子的表達量也發生了相應改變。因而1-G1/pDNA-p53復合物能夠在癌細胞內轉染并高效表達p53蛋白引起癌細胞凋亡（圖3）。
圖 3. PBS、1-G1、free pDNA-p53和1-G1/pDNA-p53對HeLa細胞周期及相關細胞周期因子表達的影響。（A）流式細胞術細胞周期分布圖；（B）流式細胞術細胞周期結果分析直方圖；（C）G0/G1期相關mRNA的實時定量PCR結果直方圖；（D）G0/G1期相關蛋白的蛋白質印跡結果；（E）蛋白質印跡結果的分析直方圖。
隨后，研究團隊更深入地研究了CPD用于皮下移植瘤模型基因治療的可能性。研究發現，1-G1/pDNA-p53治療組中，p53、p21蛋白表達水平均高于其他各組(p < 0.001)，且細胞周期因子Cdk-4和cyclind1表達水平低于其他各組，與體外基因傳遞數據一致（圖4）。這些結果表明，制備的陽離子型含磷樹狀大分子（1-G1）有可能作為一種高效載體系統用于癌癥基因治療或其它疾病的基因治療。
圖 4.（A）1-G1/pDNA-p53復合物體內腫瘤基因治療示意圖；（B）經生理鹽水（normal saline, NS）、1-G1、free pDNA-p53 和 1-G1/pDNA-p53治療后，皮下瘤中相關蛋白的免疫印跡結果；（C）蛋白質印跡結果的分析直方圖。
以上研究以“Revisiting Cationic Phosphorus Dendrimers as a Nonviral Vector for Optimized Gene Delivery Towards Cancer Therapy Applications”為題，發表在美國化學會期刊Biomacromolecules (DOI: 10.1021/acs.biomac.0c00458)上。東華大學化學化工與生物工程學院博士研究生陳亮和李錦為共同第一作者，東華大學史向陽教授、法國國家科學研究中心Jean-Pierre Majoral教授和巴黎第五大學Serge Mignani教授為共同通訊作者。該工作得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金委、上海市科委和中法蔡元培等項目的資助。
論文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biomac.0c00458
