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  免疫治療已發(fā)展成為繼手術(shù)、放療和化療之后的第四大腫瘤治療手段。其中，基于T細(xì)胞的過(guò)繼性細(xì)胞免疫療法（ACT）是一大熱點(diǎn)研究方向，其策略是體外分離、修飾改造和擴(kuò)增患者的T細(xì)胞后回輸患者體內(nèi)，以激發(fā)自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對(duì)腫瘤的殺傷能力。目前，這種手段已在部分實(shí)體瘤治療中表現(xiàn)出良好的效果。然而，在治療及療效評(píng)價(jià)過(guò)程中，如何對(duì)T細(xì)胞及其活力進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)示蹤仍是亟待解決的重要技術(shù)難題。

  鈣離子（Ca²⁺）作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，與細(xì)胞增殖死亡、組織器官發(fā)育中的許多生化反應(yīng)過(guò)程密切相關(guān)。在T細(xì)胞中，鈣離子同樣有著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，其濃度水平可以反映T細(xì)胞的激活狀態(tài)。基于這一原理，東華大學(xué)史向陽(yáng)教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)構(gòu)建了一種可用于T細(xì)胞CT和熒光雙模態(tài)成像的樹(shù)狀大分子包裹納米金顆粒探針（{(Au⁰)₂₅-G5.NHAc-(PEG)₁₄-(Fluo-4)₂} DENPs），實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞及其活力監(jiān)測(cè)和示蹤。課題組以第五代聚酰胺胺（PAMAM）樹(shù)狀大分子為平臺(tái)，在其內(nèi)部包裹納米金顆粒用于CT成像，外圍通過(guò)酯鍵共價(jià)修飾鈣信號(hào)傳感分子Fluo-4用于熒光成像（圖1）。Fluo-4具有很高的鈣離子親和力，當(dāng)它以游離形式存在時(shí)幾乎無(wú)熒光，但與細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)合后則會(huì)激發(fā)出較強(qiáng)的綠色熒光，從而可以直觀地反映T細(xì)胞內(nèi)鈣離子的水平及T細(xì)胞的激活狀態(tài)。

圖 1. 納米探針 {(Au⁰)₂₅-G5.NHAc-(PEG)₁₄-(Fluo-4)₂} DENPs的合成示意圖。

  研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)核磁共振氫譜、紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜等手段對(duì)獲得的探針材料進(jìn)行表征，結(jié)果均顯示Fluo-4可成功修飾于樹(shù)狀大分子表面（圖2）。探針的細(xì)胞相容性良好，在濃度達(dá)到5 μM時(shí)，仍能保證T細(xì)胞維持90 %以上細(xì)胞活力。同時(shí)探針也具有較高的T細(xì)胞攝取效率，探針對(duì)T細(xì)胞的標(biāo)記效率高達(dá)84.6%。

圖 2. （a）未連接Fluo-4的對(duì)照組 {(Au⁰)₂₅-G5.NHAc-(PEG)₁₄ DENPs（綠）、探針 {(Au⁰)₂₅-G5.NHAc-(PEG)₁₄-(Fluo-4)₂} DENPs（紅）、游離態(tài)Fluo-4（藍(lán)）、商用鈣熒光探針Fluo-4, AM（紫）的紫外吸收光譜圖；（b）游離態(tài)Fluo-4（綠）、商用鈣熒光探針Fluo-4, AM（紅）、探針{(Au⁰)₂₅-G5.NHAc-(PEG)₁₄-(Fluo-4)₂} DENPs（藍(lán)）在Ca-EGTA高鈣緩沖溶液中的熒光發(fā)射光譜圖。

  為了驗(yàn)證納米探針對(duì)T細(xì)胞的活力探測(cè)，研究團(tuán)隊(duì)利用聯(lián)合激活劑PMA/Iono活化T細(xì)胞，首先通過(guò)測(cè)試T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子γ-干擾素和白介素-2確認(rèn)T細(xì)胞的激活。進(jìn)而采用探針對(duì)不同活化時(shí)間后的T細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明修飾了Fluo-4的樹(shù)狀大分子納米探針在被T細(xì)胞攝取后，探針上連接的Fluo-4分子能夠被胞內(nèi)酯酶剪切而游離出來(lái)，與鈣離子結(jié)合并產(chǎn)生熒光，顯示出和商用鈣熒光探針Fluo-4, AM相近的胞內(nèi)熒光成像效果。同時(shí)，隨著活化時(shí)間的延長(zhǎng)，胞內(nèi)鈣離子濃度上升，熒光強(qiáng)度也隨之提升，顯示出探針具有動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)T細(xì)胞激活狀態(tài)的潛力（圖3）。

圖3. PBS、探針 {(Au⁰)₂₅-G5.NHAc-(PEG)₁₄-(Fluo-4)₂} DENPs、商用鈣熒光探針Fluo-4, AM與被PMA/Iono活化0、4、18小時(shí)的T細(xì)胞共孵育4小時(shí)后的熒光檢測(cè)結(jié)果。（a）激光共聚焦顯微鏡熒光圖；（b）流式細(xì)胞術(shù)熒光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果；（c）流式細(xì)胞術(shù)熒光強(qiáng)度結(jié)果分析直方圖。

  隨后，課題組將標(biāo)記了納米探針的激活的T細(xì)胞注射在小鼠皮下，進(jìn)而通過(guò)CT和活體熒光顯像監(jiān)測(cè)T細(xì)胞的定位。研究發(fā)現(xiàn)，注射五分鐘后，注射部位即能發(fā)現(xiàn)明顯增強(qiáng)的CT信號(hào)，同時(shí)熒光強(qiáng)度也有所增加（圖4）。兩種成像結(jié)果互相印證，顯示所合成的納米探針在標(biāo)記T 細(xì)胞后能夠?qū)崿F(xiàn)其在小鼠體內(nèi)的CT/熒光雙模態(tài)成像示蹤。

圖 4. PMA/Iono活化18小時(shí)的T細(xì)胞標(biāo)記探針 {(Au⁰)₂₅-G5.NHAc-(PEG)₁₄-(Fluo-4)₂} DENPs后，在小鼠背部皮下注射后的T細(xì)胞成像示蹤結(jié)果。（a）CT成像結(jié)果圖；（b）注射前后CT信號(hào)值；（c）小動(dòng)物熒光成像結(jié)果圖；（d）注射前后相對(duì)熒光強(qiáng)度。

  以上研究以“Multifunctional Dendrimer-Entrapped Gold Nanoparticles for Labeling and Tracking T Cells Via Dual-Modal Computed Tomography and Fluorescence Imaging”為題，發(fā)表在美國(guó)化學(xué)會(huì)期刊Biomacromolecules (DOI: 10.1021/acs.biomac.0c00147)上。第一作者為東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院的碩士研究生陳玫秀，東華大學(xué)的史向陽(yáng)教授和以色列巴伊蘭大學(xué)的Rachela Popovtzer教授為共同通訊作者。該工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃政府間國(guó)際科技創(chuàng)新合作重點(diǎn)專項(xiàng)項(xiàng)目、國(guó)家自然基金委、上海市科委等項(xiàng)目的資助。

  論文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biomac.0c00147