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  多肽是組成生命體的一類重要生物大分子，種類多樣且承載重要生物學功能。研究和模擬多肽，不僅可以探索生命奧秘，也能推動很多重要的應用研究，包括組織工程、藥物開發、生物材料等，并可以針對性解決天然多肽在體內穩定性差、容易被蛋白酶水解等突出缺點對應用的局限。但是，目前可用的多肽模擬物僅有以擬肽和beta-多肽為代表的極少種類。因此，發展新類型的多肽模擬物具有重要的基礎研究意義和廣泛應用潛力。

  劉潤輝教授課題組近日在Angew. Chem. Int. Ed發表研究論文（VIP論文），首次實現基于惡唑啉聚合物（聚惡唑啉）的多肽模擬；以宿主防御肽為模型展示了以聚惡唑啉實現對多肽的功能性模擬，并獲得對耐甲氧西林金葡菌（MRSA）的體內、體外高效抗菌活性。自1966年聚惡唑啉被首次報導以來，由于其優異的生物相容性和親水性特點，作為聚乙二醇（PEG）的類似物在藥物遞送和自組裝材料等領域展現了優異的功能和廣闊的應用前景。該研究論文基于聚惡唑啉與天然多肽骨架結構的相似性，提出以聚惡唑啉模擬多肽，首次實現了聚惡唑啉對多肽的功能性模擬，開辟了可用于多肽模擬的一類新結構（圖1）。

圖1. Current and new peptide mimicking structures.

  為了驗證以聚惡唑啉進行多肽功能性模擬的可行性，作者以宿主防御肽作為研究模型多肽，設計了具有抗菌功能的宿主防御肽模擬物，并合成了具有甘氨酸側鏈的不同鏈長聚惡唑啉 (簡稱Gly-POX)。其中，優選聚合物Gly-POX₂₀顯示了對耐藥菌MRSA的高效殺菌活性和很低的細胞毒性，并顯示了相對于傳統抗生素的幾項突出優點（圖2）：1）對多種多藥耐藥菌株仍然具有高效抗菌活性；2）連續使用Gly-POX₂₀下，細菌經過近1000代也未出現耐藥性，而細菌對于抗生素很快獲得耐藥性，甚至高達256倍；3）經Gly-POX₂₀刺激近1000代后的細菌對常規抗生素敏感度不變，未發現交叉耐藥問題，而經過抗生素刺激的細菌對其他抗生素同樣出現了交叉耐藥性；4）Gly-POX₂₀對高度耐藥的休眠細胞同樣有效，抗生素則無效。聚惡唑啉抗菌分子的上述突出優點可針對性的解決耐藥微生物感染的核心難題。

圖2. (A) Synthesis of HDP mimetics Gly-POX_n. (B) GPC traces of representative N-Boc protected Gly-POX_n. (C) MIC values of the Gly-POX_n with variable chain length against S. aureus using representative HDP magainin II as the control. (D) The MIC and MBC values of Gly-POX₂₀ against S. aureus (S.a), S. epidermis (S.e) and B. nsubtilis (B.sub). (E) Antimicrobial resistance test on Gly-POX₂₀ and Norfloxacin against S. aureus ATCC6538. (F) The change of MBC in antibiotics against Gly-POX₂₀ and norfloxacin treated S. aureus. S.a-Gly-POX₂₀-P928 was the S. aureus obtained after being treated with POX₂₀ continuously at 0.5×MBC concentration for 928 generations. S.a-Nor-P327 was the S.aureus obtained after being treated with norfloxacin continuously at 0.5×MBC concentration for 327 generations. (G) Killing kinetics of Gly-POX₂₀ at 4×MIC against MRSA persisters generated by 10×MIC ciprofloxacin treatment.

  使用熒光分子標記的Gly-POX₂₀通過熒光共聚焦顯微鏡觀察Gly-POX₂₀的殺菌過程發現，Gly-POX₂₀并未在膜表面聚集，而是直接穿過了細胞膜在細菌內部聚集，且沒有對細胞膜產生破壞（圖3）。進一步研究發現，Gly-POX₂₀與細菌內的DNA之間有很強的相互作用，且Gly-POX₂₀進入細菌內后導致細菌內的ROS水平在10min內提高了一倍。通過原位淬滅大量生成的ROS并保持 ROS在細菌正常水平，發現Gly-POX₂₀的抗菌活性完全喪失。綜上，作者推測Gly-POX₂₀的抗菌機理為：化合物選擇性穿透細菌細胞膜進入細菌內部并和DNA發生強相互作用，導致細菌產生大量ROS從而殺死細菌。這種機理也解釋和支持了前面所述聚惡唑啉抗菌化合物對于多重耐藥菌和休眠細胞保持高活性和細菌無法獲得耐藥性的突出優點。

圖3. (A) Synthesis of morpholino-naphthalimide dye conjugated Gly-POX₂₀ (Dye-Gly-POX₂₀). (B) Time-laps fluorescent confocal imaging on the interaction between S. aureus and Dye-Gly-POX₂₀ (at 1×MBC) in the presence of propidium iodide. (C) Ortho view of Z-stack images on S. aureus after incubation with Dye-Gly-POX₂₀ (at 1×MBC) for 1260s. (D) Gly-POX₂₀-induced S. aureus cytoplasmic membrane depolarization assay. (E) The electrophoretic mobility shift assay of plasmid DNA and the mixture of plasmid DNA-complexes at different ratios of N:P (Gly-POX₂₀:DNA). (F) Intracellular ROS intensity produced by S. aureus in the presence of PBS, Gly-POX₂₀ (at 1×MBC), and the mixture of Gly-POX₂₀(1×MBC) and NAC (10 mM). ** p<0.01. (G) MBC value of Gly-POX₂₀ against S. aureus in the presence or absence of NAC (10 mM). 

  論文還通過大鼠全皮層傷口MRSA感染模型驗證了Gly-POX₂₀的動物活體抗菌效果（圖4）。發現：Gly-POX₂₀顯示出與最后一線抗生素萬古霉素相當的體內殺菌活性；Gly-POX₂₀治療的傷口修復速度比萬古霉素略快；Gly-POX₂₀和萬古霉素治療的修復傷口顯示炎性浸潤明顯減少。這些結果進一步支持了Gly-POX₂₀在抗MRSA感染的應用潛力。

圖4. In vivo antibacterial efficacy study using a rat full-thickness wound model of MRSA infection. (A) Description of the in vivo infectious animal model using S. aureus USA300 LAC. (B) Cell density of S. aureus in infected tissues on day 1 after treatment with 250 MIC Gly-POX₂₀ and vancomycin (Van). ** p<0.01. (C) Infected wound photographs at defined time points showing representative result from 6 individual animals in each group. (D) Wound closure analysis expressed relative to the original size of the wound at day 0. Data are presented as the mean (n ≥ 3 in each group). (E) Histological analysis on wound tissue sections stained with H&E on day 11 after antimicrobial treatment (blue arrow: inflammatory cells; green arrow: fibroblasts; yellow arrow: new collagen; orange arrow: new blood vessels; black arrow: calcareous clumps along with multicellular macrophages).

  劉潤輝教授課題組通過聚惡唑啉實現了多肽功能模擬，展示了一種新類型的多肽模擬物，在多肽模擬相關的多個領域有廣闊的研究潛力；首次實現了基于聚惡唑啉的宿主防御肽模擬，開創了新的研究方向和思路，有望用于解決耐藥微生物感染這一全球性的嚴峻挑戰。該研究成果以題為“Poly(2-Oxazoline) Based Functional Mimics of Peptides to Eradicate MRSA Infections and Persisters While Alleviating Antimicrobial Resistance” 發表在《德國應用化學》(Angewandte Chemie International Edition)，并被選為VIP論文。

  華東理工大學材料科學與工程學院博士生周敏是該成果的第一作者，華東理工大學劉潤輝教授是唯一通訊作者。該研究得到了國家自然科學基金委、科技部等基金的資助。

  論文鏈接:  https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/ange.202000505