近日，香港科技大學(xué)唐本忠院士課題組報道了一種簡單的無金屬參與、無預(yù)修飾的一步法生物偶聯(lián)新策略，實現(xiàn)多級對象的功能化標(biāo)記與應(yīng)用，如天然高分子、合成高分子、多肽、蛋白質(zhì)、活細(xì)胞快速染色、活細(xì)菌快速識別染色、無機材料修飾等，以題為 “A Simple Approach to Bioconjugation at Diverse Levels: Metal-Free Click Reactions of Activated Alkynes with Native Groups of Biotargets without Prefunctionalization”發(fā)表在Research上 (Research, 2018, 3152870, DOI: 10.1155/2018/3152870)。
在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，探索生物分子的結(jié)構(gòu)、示蹤其發(fā)揮作用的內(nèi)在機制與過程非常重要，但是采用什么技術(shù)手段使這些內(nèi)在過程“可視化”是一項非常富有挑戰(zhàn)的工作。目前，多數(shù)生物分子和生物材料自身沒有可以用作有效觀察的熒光，通常采用偶聯(lián)熒光分子或者其他成像單元來實現(xiàn)生物靶標(biāo)分子的示蹤。
生物偶聯(lián)反應(yīng)通常要求反應(yīng)效率高，不產(chǎn)生額外副產(chǎn)物或僅產(chǎn)生氮氣或水。傳統(tǒng)的生物偶聯(lián)策略往往需要重金屬催化，如銅，或需要復(fù)雜的多步前修飾處理，重金屬殘留造成的潛在毒性不利于后續(xù)生物應(yīng)用；待修飾對象的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性限制了其預(yù)修飾；如蛋白質(zhì)是生命體中重要的構(gòu)筑單元，其結(jié)構(gòu)和功能非常復(fù)雜，預(yù)修飾本身已存在顯著的挑戰(zhàn)。
另外，針對活細(xì)胞的全細(xì)胞成像，甚至對生命體的熒光標(biāo)記始終是個難題，傳統(tǒng)的方法采用基因手段，但操作復(fù)雜，不確定性高。總之，由于被修飾生物對象的復(fù)雜性，迫切需要發(fā)展一種廣泛適用、無金屬參與、不需要預(yù)修飾的簡單偶聯(lián)策略，用于對不同生物靶標(biāo)分子甚至對生命體的直接修飾標(biāo)記，具有重要的學(xué)術(shù)與轉(zhuǎn)化價值。
香港科技大學(xué)唐本忠院士團隊通過活化炔與胺基、硫醇、醇的高效偶聯(lián)反應(yīng)，實現(xiàn)多級對象的生物偶聯(lián)標(biāo)記（圖1）。并分別舉例進(jìn)行概念性說明，首先，基于伯胺與活化炔的生物偶聯(lián)策略，可用于修飾殼聚糖或一步法簡易實現(xiàn)PEGylation, 偶聯(lián)產(chǎn)物具有發(fā)光特性，可用于細(xì)胞成像等（圖2）。
圖1 基于活化炔的生物偶聯(lián)平臺可以實現(xiàn)多級對象的無預(yù)修飾偶聯(lián)熒光標(biāo)記
圖2 基于伯胺與活化炔的生物偶聯(lián)策略修飾殼聚糖和簡易實現(xiàn)PEGylation
其次，基于巰基與活化炔的高效偶聯(lián)，可用于合成高分子的端基修飾 (如RAFT聚合的高分子產(chǎn)物)，為后續(xù)合成高分子的生物應(yīng)用提供了眾多可能性；基于羥基與活化炔的偶聯(lián)還可用于多糖改性，此過程僅需要加入催化量的有機堿，不需要添加金屬催化劑（圖3）。再次，在廣泛驗證了活化炔與胺基、巰基和醇類反應(yīng)性以后，作者利用多肽和蛋白質(zhì)固有的伯胺或巰基進(jìn)行無金屬催化的生物偶聯(lián)標(biāo)記，并對多肽和蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能進(jìn)行初步驗證（圖4）。
圖3 基于巰基與活化炔的偶聯(lián)用于合成高分子端基修飾 (如RAFT聚合的高分子產(chǎn)物), 基于羥基與活化炔的偶聯(lián)也可用于多糖改性
圖4 基于多肽和蛋白質(zhì)固有的伯胺、巰基進(jìn)行無金屬催化的生物偶聯(lián)標(biāo)記
最后，作者嘗試將活化炔用于復(fù)雜體系的偶聯(lián)標(biāo)記研究。如將活化炔小分子直接用于細(xì)胞標(biāo)記染色，并以不含炔的熒光小分子或炔被加成后的熒光產(chǎn)物進(jìn)行平行試驗，驚奇地發(fā)現(xiàn)，活化炔熒光探針可以在短短2分鐘內(nèi)完成全細(xì)胞染色，而對照分子不能在如此短的時間里完成染色（圖5）。基于活化炔與胺基或巰基快速偶聯(lián)特征，作者推測活化炔小分子首先與細(xì)胞膜表面富含的胺基和巰基的蛋白質(zhì)快速反應(yīng)，這些蛋白質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)快速轉(zhuǎn)運過程中同時帶入標(biāo)記的熒光探針，從而實現(xiàn)全細(xì)胞的快速染色。
圖5 基于活化炔的熒光探針可以快速全細(xì)胞染色，兩分鐘可以完成染色
隨后，作者分別選取典型的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，進(jìn)一步將上述3種熒光分子與這些細(xì)菌分別培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)活化炔熒光分子在2分鐘內(nèi)完成陽性菌快速染色，而兩個對照熒光分子與兩種典型的陽性菌共孵育30分鐘都無法染色陽性菌；另外，包括活化炔熒光分子在內(nèi)的3種熒光分子均無法在短時間內(nèi)染色標(biāo)記革蘭氏陰性菌；綜合分析，陽性菌膜表面富含大量突起的磷壁酸組分，其含有大量伯胺基元，可以快速與活化炔熒光分子反應(yīng)，從而快速染色陽性菌，而陰性菌膜表面沒有磷壁酸組分，且其復(fù)雜的膜結(jié)構(gòu)本身就不利于小分子物理滲入（圖6），預(yù)期基于活化炔的熒光探針將為細(xì)菌快速識別篩選提供重要幫助。
圖6 基于活化炔的熒光探針快速識別染色革蘭氏陽性菌，兩分鐘可完成
基于活化炔的高效偶聯(lián)，作者還驗證了微米級二氧化硅球的熒光標(biāo)記，說明該偶聯(lián)策略可以拓展到無機材料的表面修飾與功能應(yīng)用。因此，基于活化炔的無金屬參與、無預(yù)修飾的一步法生物偶聯(lián)策略不僅是生物靶標(biāo)分子標(biāo)記的一個通用平臺，還為有機材料和無機材料的修飾提供了一種通用方法，有望為生物學(xué)、化學(xué)、材料科學(xué)以及相關(guān)交叉學(xué)科研究提供技術(shù)支持，具有尤為重要的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。
