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  最近，香港科技大學唐本忠院士團隊與山東大學于曉強教授團隊在Chemistry of Materials上發表了題為“Specific Two-Photon Imaging of Live Cellular and Deep-Tissue Lipid Droplets by Lipophilic AIEgens at Ultralow Concentration”的研究論文（Chem. Mater., 2018, 30, 4778），報道了一類脂溶性AIE材料在超低濃度下對活細胞和深層組織中脂滴的特異性雙光子成像。

  脂滴，是一種廣泛存在于大多數細胞和生物體系中的動態細胞器，參與了許多重要的生理功能，包括脂質代謝、膜合成和轉移、信號轉導、蛋白質降解等。近年來研究發現，脂滴與肥胖、糖尿病、炎癥和癌癥等緊密相關。因此，開發出有效的方法對活細胞和活組織樣本中脂滴的直接和選擇性可視化和監測顯得格外重要。

Scheme 1. 商用和文獻報道的脂滴熒光探針結構

（來源：Chem. Mater.）

  Nile Red和BODIPY 493/503是常用的脂滴染色商用熒光染料（Scheme 1），不過它們存在著非特異性染色、Stokes位移小和光穩定性差等缺點。近年來，為了解決這些問題，國內外研究組做了很大努力，開發了多種新型脂滴熒光探針（Scheme 1）。通常用于脂滴染色的探針濃度在5-10 μM或更高的范圍內，但這些染料由于存在聚集熒光猝滅（ACQ）效應而顯示弱的熒光。只有少數染料能在納摩爾濃度下對脂滴成像，然而這些染料在活細胞內顯示非特異性染色和藍色熒光，從而導致低的信噪比。另一方面，這些基于ACQ的染料具有小的Stokes位移和低的光穩定性，并且其在雙光子深層組織熒光成像中的應用也很少被探索。這些局限性促使研究人員尋找具有更好性能（比如雙光子深層組織成像、低孵育濃度、大Stokes位移、高光穩定性和優異的生物兼容性）的新型熒光探針。

Scheme 2. 唐本忠院士團隊開發的用于脂滴熒光成像的AIEgens

（來源：Chem. Mater.）

  2001年，香港科技大學唐本忠院士提出了與ACQ效應完全相反的聚集誘導發光（AIE）現象，其具有重要的學術價值和實際意義。基于此，團隊開發了一系列多色發射、高光穩定性和優異生物兼容性的AIE熒光材料（AIEgens，Scheme 2），用于選擇性脂滴熒光成像，并且實現了細胞和固定組織中脂滴的雙光子熒光成像。考慮到活體樣品中高濃度染料的成像可能會影響細胞的正常生理活動，因此，開發出能夠在低濃度下發揮作用的新型雙光子AIEgens是很有必要的。此外，很少有人關注上述ACQ染料和AIEgens的固有特征與活細胞中脂滴染色特性之間的關系。

  由于高含量甘油三酯和膽固醇酯的存在，脂滴內的固有環境是親脂性的，故具有高疏水性的親脂性有機染料可能顯示出潛在的靶向脂滴染色能力。具有給體-受體結構的有機染料已被研究了很長一段時間，通過引入大的雜環以增加受體的吸電子能力，所得有機染料通常發生紅移，并具有更高的疏水性和更大的雙光子吸收截面，但是細胞穿透性也變得更低。因此，有機熒光材料的疏水性和細胞滲透性之間的平衡應該仔細權衡和調整。另一方面，基于萘的給體-受體分子已經被證明是雙光子熒光探針，并用于活細胞中熒光檢測和生物成像。然而，萘卻很少被用作構建AIEgens的核。通過引入不同的受體結構單元，作者合成了一系列基于萘的給體-受體新型雙光子AIEgens體系（NAP AIEgens，Figure 1）, 并在超低濃度下實現對活細胞和深層組織中脂滴的特異性雙光子熒光成像。

Figure 1. NAP AIEgens的分子結構

（來源：Chem. Mater.）

  作者首先詳細地研究了這類基于萘的給體-受體熒光材料的光物理性質（Table 1）。研究發現，由于分子內運動，它們在THF溶液中顯示非常弱的熒光（熒光量子產率：1.4-1.8%）；在含水量高的THF中，材料的熒光顯著增強，動態光散射結果證明這類熒光材料在溶液中形成了聚集體。重要的是，這些熒光材料由于分子內運動受限（RIM），在固態顯示出非常亮的黃綠光至紅光的發射（熒光量子產率：12.6-29.2%），證明此類材料是AIE熒光材料。相對于溶液中短的熒光壽命，固體中長的熒光壽命進一步證實了RIM是NAP AIEgens固體熒光增強的原因。NAP AIEgens也具有大的Stokes位移、正的溶致變色效應和好的雙光子吸收截面（在860 nm處為45-100 GM）。

Table 1. NAP AIEgens的光物理性質

（來源：Chem. Mater.）

  作者接下來探索了這些NAP AIEgens在活細胞中的成像效果。原位光譜顯示它們在細胞內的熒光均發生了藍移，這主要是分子內電荷轉移和細胞內非極性環境導致的。細胞共染實驗揭示了NAP AIEgens和商用脂滴染料Nile Red在HeLa細胞中具有相似的染色分布（Figure 2），相應的Pearson系數分別是0.90、0.83、0.85和0.88，從而證實了這4個NAP AIEgens是新型的脂滴探針。

Figure 2. NAP AIEgens和Nile Red的細胞共染實驗結果

（來源：Chem. Mater.）

  為了合理解釋NAP AIEgens對脂滴的高度特異性，作者進行了一些初步的計算。考慮到脂滴內固有的親脂性環境，作者推測具有高疏水性或高logP（油水分配系數）值的脂溶性有機染料很可能特異性靶向脂滴，這也符合相似相溶的原理。作者通過ChemBioDraw 14.0得到了所有脂滴探針的計算的logP（即ClogP）值，發現ClogP值分布在3.1-16.643之間。Horobin等人之前基于QSAR模型報道了靶向脂滴的有機染料的logP值一般大于5。另人滿意的是，NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py具有比Nile Red（4.618）和BODIPY 493/503（5.028）大的ClogP值（5.184-6.681，Figure 3），這可能解釋了為什么這些NAP AIEgens比Nile Red顯示出更好的脂滴染色效果。這些半理論性數據進一步表明了這些親脂性AIEgens可以特異性地定位在脂滴中。

Figure 3. Nile Red、BODIPY 493/503和NAP AIEgens的ClogP值

（來源：Chem. Mater.）

  作者進一步對孵育了50 nM NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py的HeLa細胞進行熒光成像，同時也對Nile Red在相同濃度下的染色效果做了對比。令人驚訝的是，在如此低的濃度和共聚焦激光強度（405 nm，強度=12％）下，NAP AIEgens也在脂滴中獲得了強熒光，并且背景熒光很低（Figure 4）。到目前為止，這是對脂滴染色成像的最低濃度。盡管Nile Red也可在此低濃度下脂滴成像，但它在細胞質中顯示出非特異性的染色，導致低的信噪比。顯然，NAP AIEgens比Nile Red顯示出更優異的脂滴染色效果。

Figure 4. NAP AIEgens和Nile Red與HeLa細胞的激光共聚焦掃描成像

（來源：Chem. Mater.）

  NAP AIEgens對活細胞中脂滴的特異性單光子熒光成像，促使了它們在雙光子激發模式下的成像應用。如Figure 5A中所示，活的HeLa細胞中脂滴的亮綠色熒光在雙光子860 nm的激發下成功被觀察到，這幾乎與單光子405 nm激發觀察到的分布情況相同，顯示了NAP AIEgens在雙光子熒光成像中的巨大潛質。由于近紅外光激發和低激發功率，雙光子熒光成像相對于單光子熒光成像表現出深的組織穿透深度和低的背景熒光。為了進一步證實這些優點，作者對NAP-CF3孵育的活的小鼠肝組織進行了離體雙光子熒光成像。1 μM的NAP-CF3孵育1 h后，明亮的雙光子熒光球形斑點被成功觀測到（Figure 5B）；而在空白對照實驗組中，作者只收集到了非常弱的組織自發背景熒光。這些數據表明，NAP-CF3在活的小鼠肝組織中也顯示出優異的脂滴染色特性，并具有高信噪比。

Figure 5. 活的HeLa細胞和活的小鼠肝組織中脂滴的體外和離體雙光子熒光成像

（來源：Chem. Mater.）

  為了進一步探索NAP-CF3能否在活的小鼠深層肝組織中顯示對脂滴的特異性染色，作者沿Z軸捕獲了一系列雙光子熒光成像圖。如Figure 5C所示，球形斑點的雙光子熒光能夠沿著Z軸被清晰探測，并且穿透深度達70 μm，這是首次活的深層組織中脂滴的特異性雙光子熒光成像。此外，作者沿不同顯示方向成功地重建了具有高分辨率的3D雙光子熒光圖像，結果證明NAP-CF3的雙光子成像具有高穿透性和高信噪比。脂肪肝疾病的特征是脂滴中脂質儲存水平增加，并且可逐漸導致慢性肝損傷、纖維化甚至肝細胞癌。Oil Red O染色可以用于該類疾病的診斷，但Oil Red O只能染色固定組織，而固定組織的處理和固定組織切片的制備比較耗時。相對于熒光成像方法來說，Oil Red O染色的靈敏度低并且穿透深度淺。考慮到NAP-CF3具有深的組織穿透深度、高靈敏度和高選擇性，NAP-CF3不僅可以在深層組織中高信噪比地研究脂滴相關的變化，同時也可以提供一種簡單、快速、可靠的方法來診斷與脂滴相關脂肪肝等疾病。

Figure 6. NAP AIEgens和 Nile Red的光穩定性以及NAP AIEgens的細胞毒性

（來源：Chem. Mater.）

  為了評估NAP AIEgens的光穩定性，作者使用共聚焦激光持續照射它們染色的細胞并收集其熒光信號。持續10 min光照后，NAP-CF3和NAP-Py依然保留著高達90%的起始熒光強度，其他NAP AIEgens和Nile Red的熒光強度則有不同程度的降低（Figure 6A）。標準MTT試驗評估了NAP AIEgens在活細胞中的毒性。NAP AIEgens在HeLa細胞中孵育2 h后，HeLa細胞的存活率仍然很高（>90%, Figure 6B），表明這些AIE材料在所測試的濃度內表現出可忽略的細胞毒性并且與活體樣品是生物兼容的。

  總結：在此工作中，作者合成了4種基于萘的新型聚集誘導發光材料并用于特異性雙光子脂滴成像。它們的光物理性質通過單光子和雙光子熒光光譜、密度泛函理論（DFT）計算和單晶X射線衍射進行了研究。這些新的AIE材料具有大的Stokes位移（>110 nm）、高固態熒光量子產率（高達30％）、良好的雙光子吸收截面（在860 nm處為45-100 GM）、優異的光穩定性和生物兼容性等優點。這些材料可以在15 min內實現對脂滴特異性超低濃度（50 nM）成像，該濃度是目前報導的活細胞中脂滴染色的最低值。計算的油水分配系數進一步揭示了這些脂溶性聚集誘導發光材料能夠特異性靶向脂滴。這類AIE材料在活細胞和活的小鼠肝臟組織中成功實現了脂滴的體外和離體雙光子熒光成像；在約70 μm深的活的小鼠肝組織中也成功實現了對脂滴選擇性可視化。這些優異的性能使得NAP AIEgens成為研究活體生物樣品中脂滴相關生理和病理過程的優異候選熒光探針。

  該論文的第一作者是香港科技大學牛廣樂博士，張若瑤博士和研究生鄺培竣為共同第一作者。香港科技大學唐本忠院士和山東大學于曉強教授為共同通訊作者。該研究得到國家自然科學基金委、山東省自然科學基金委、深圳市科技創新委員會等經費支持。

  論文鏈接：https://www.researchgate.net/publication/326133224_Specific_Two-Photon_Imaging_of_Live_Cellular_and_Deep-Tissue_Lipid_Droplets_by_Lipophilic_AIEgens_at_Ultralow_Concentration