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  抗生素濫用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性已成為當(dāng)今社會面臨的嚴(yán)重威脅，因此亟需發(fā)展新型抗菌試劑。相較于抗生素，抗菌肽具有高殺菌活性、廣譜抗菌性、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前抗菌領(lǐng)域的研究前沿和熱點(diǎn)。盡管已有多種抗菌肽被報(bào)道，但其作用機(jī)制尚不完全明確，部分原因是由于SEM、TEM、AFM等常規(guī)觀測手段，僅能提供抗菌肽與細(xì)菌結(jié)合后的靜態(tài)信息，難以揭示抗菌肽與細(xì)菌結(jié)合的動態(tài)過程。

  相對于上述靜態(tài)成像技術(shù)，熒光成像具有成本低、易于操作、可實(shí)時原位觀測等優(yōu)點(diǎn)。由于抗菌肽在殺滅細(xì)菌時，通常需要高濃度聚集于細(xì)菌的表面或內(nèi)部，而傳統(tǒng)熒光染料存在聚集猝滅發(fā)光（ACQ）的缺陷，難以用于抗菌肽的作用機(jī)制研究。此外，傳統(tǒng)熒光染料光穩(wěn)定性差，難以長期實(shí)時監(jiān)測抗菌肽與細(xì)菌的結(jié)合過程。因此，發(fā)展能夠克服ACQ缺陷，且簡便易得、光穩(wěn)定性好的熒光探針，實(shí)時原位監(jiān)測抗菌肽與細(xì)菌的結(jié)合過程，對揭示抗菌肽的作用機(jī)制具有重要意義。

  聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）材料具有聚集態(tài)發(fā)光效率高、斯托克位移大、生物相容性好、抗光漂白能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。近日，香港科技大學(xué)唐本忠院士團(tuán)隊(duì)與華南理工大學(xué)王迎軍院士團(tuán)隊(duì)合作，通過在抗菌肽HHC36（KRWWKWWRR）上修飾AIE分子2-(2-羥基苯基)苯并噻唑（HBT），制備了AIE探針AMP-2HBT（圖1），不僅保持了HHC36多肽的抗菌活性，而且由于其在稀溶液中發(fā)光很弱，可通過熒光“點(diǎn)亮”的方式，實(shí)時觀測抗菌肽與細(xì)菌的結(jié)合過程，進(jìn)一步通過STORM超分辨熒光成像、SEM和TEM成像，有效揭示了抗菌肽HHC36通過破壞細(xì)菌膜的結(jié)構(gòu)從而殺滅細(xì)菌的機(jī)制。

圖1 AIE探針AMP-2HBT的分子結(jié)構(gòu)及其與細(xì)菌結(jié)合后點(diǎn)亮熒光并殺滅細(xì)菌的過程示意圖。

  通過比較抗菌肽HHC36與探針AMP-2HBT的殺菌效率，發(fā)現(xiàn)在HHC36多肽上修飾HBT分子，并未影響其殺菌活性（圖2）。例如，在10，20，50，100 μM濃度時，HHC36多肽和AMP-2HBT探針對大腸桿菌的殺滅效率分別為84.25，94.64，99.68，99.84%和87.56，94.33，99.53，99.95%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AMP-2HBT探針可迅速抑制細(xì)菌的活性，當(dāng)將20 μM探針加入至細(xì)菌溶液（107 CFU mL–1）中時，所有細(xì)菌在2 min內(nèi)即停止運(yùn)動。

圖2 (A) 不同濃度HHC36多肽及AMP-2HBT探針對大腸桿菌的殺菌效率；(B) 加入AMP-2HBT探針后，大腸桿菌的運(yùn)動活性隨時間的變化。

  探針AMP-2HBT具有典型的AIE性質(zhì)，當(dāng)其在稀溶液中時，由于分子內(nèi)運(yùn)動，熒光很弱；當(dāng)其與細(xì)菌結(jié)合后，分子內(nèi)運(yùn)動受限，發(fā)出強(qiáng)熒光（圖3A）。因此探針AMP-2HBT可用于細(xì)菌的免洗成像，實(shí)時監(jiān)測抗菌肽與細(xì)菌的結(jié)合過程。進(jìn)一步，基于熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)（圖3B-F），隨時間的延長，AMP-2HBT探針與細(xì)菌結(jié)合的數(shù)量逐漸增加，其熒光強(qiáng)度亦逐漸增加，在30，45，60 min時，探針結(jié)合至細(xì)菌后的平均熒光強(qiáng)度分別為15 min時的2.9，4.6，6倍。

圖3 探針AMP-2HBT實(shí)時原位監(jiān)測與細(xì)菌的結(jié)合過程：(A)探針AMP-2HBT和大腸桿菌自身，及與大腸桿菌結(jié)合后的熒光光譜；(B)–(E)不同時間下細(xì)菌的熒光照片；(F)不同時間下流式分析結(jié)果。

進(jìn)一步，通過結(jié)合隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM）、掃描電鏡（SEM）和透射電鏡（TEM）分析發(fā)現(xiàn)，熒光探針AMP-2HBT可有效結(jié)合至大腸桿菌的細(xì)菌膜上（圖4），通過破壞細(xì)菌膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物流出，從而有效殺死細(xì)菌。

圖4 (A，B) AMP-2HBT結(jié)合至大腸桿菌后的STORM超分辨熒光照片；(C，D) 分別為AMP-2HBT與大腸桿菌結(jié)合前后的TEM照片；(E，F(xiàn))分別為AMP-2HBT與大腸桿菌結(jié)合前后的SEM照片。

  該工作通過在抗菌肽上修飾AIE分子，在不影響抗菌肽自身活性的前提下，可通過熒光成像實(shí)時動態(tài)觀測抗菌肽與細(xì)菌的結(jié)合過程和作用方式，有效克服了傳統(tǒng)熒光染料的聚集猝滅發(fā)光缺陷，為抗菌肽的機(jī)制研究提供了一種有效的研究工具。

  這一研究成果近期發(fā)表在《ACS Applied Materials & Interfaces》上，文章的共同第一作者為華南理工大學(xué)陳軍建博士、高蒙副研究員和王琳副研究員，本文的通訊作者為唐本忠院士、王迎軍院士和任力教授。

  論文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021%2Facsami.7b18221